王麗美 肖 俐 支 敏 呂沛穎 高鵬飛 王永蘭

牙周炎，一類由多種因素引起的牙周組織的慢性進(jìn)展性炎癥反應(yīng)，在我國，成人牙周病的發(fā)病率高達(dá)80～90%[1]。牙周炎主要侵犯牙周支持組織，晚期牙周炎還影響患者的全身健康[2～4]。肥胖作為全球范圍內(nèi)的流行病，近10 年來已有大量的研究表明其與牙周炎具有相關(guān)性[5，6]。脂肪因子作為脂肪組織分泌的一類生物活性分子被人們廣泛研究，而其中脂聯(lián)素作為唯一負(fù)性調(diào)節(jié)的因子，可以促進(jìn)脂肪酸的氧化，增加胰島素敏感性，在許多慢性炎癥疾病中發(fā)揮抗炎作用[7，8]。大量研究表明在牙周炎與肥胖相關(guān)疾病中均表征為低脂聯(lián)素血癥，而其相關(guān)機(jī)制仍不明確[9，10]。

細(xì)菌及其產(chǎn)物是牙周炎的主要始動(dòng)因子，P.g作為細(xì)菌紅色復(fù)合體中最具代表性的一員，在牙周感染位點(diǎn)尤其是深牙周袋中含量升高而被廣泛研究[11]。P.g的致病原包括牙齦素、脂多糖等，脂多糖作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜上一類最主要的大分子抗原，因其對(duì)牙周組織極高的毒性，而成為一類關(guān)鍵的毒力因子[12]。牙周組織的破壞包括牙槽骨和牙周軟組織的破壞，主要由炎癥介質(zhì)包括如IL-6 和PGE2，及組織破壞性酶包括如MMP-1 等介導(dǎo)。而TNF-α 等初級(jí)炎癥介質(zhì)可以誘導(dǎo)趨化因子向牙周組織聚集，加重結(jié)締組織的破壞和破骨細(xì)胞性骨吸收。目前關(guān)于脂聯(lián)素在牙周組織炎癥反應(yīng)中的調(diào)控，大多數(shù)研究者著眼于脂聯(lián)素直接對(duì)牙周組織炎癥介質(zhì)的影響，如Dominik 的研究[13]表明，在口腔上皮細(xì)胞中，脂聯(lián)素降低了IL-1β 和IL-6 的表達(dá)，促進(jìn)了IL-10 和血紅加氧酶-1 （heme oxygenase-1，HMOX1）表達(dá)。而關(guān)于脂聯(lián)素在牙周微生物致病方面起的調(diào)控作用目前國內(nèi)外研究甚少，有必要進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究APN 對(duì)P.gLPS 刺激HGFs 分泌TNF-α、PGE2、IL-6 和MMP-1 的調(diào)控，探索脂聯(lián)素在牙周炎致病機(jī)制中所起的作用，從而為進(jìn)一步揭示牙周炎與肥胖相關(guān)性的內(nèi)在機(jī)制提供依據(jù)。

資料和方法

一、材料

1.人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：選取自2017 年03 月至2017 年05 月因需要拔除埋伏阻生智齒在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科就診的患者共5 位（年齡18～24 歲，平均22 歲），排除患有全身系統(tǒng)性疾病如糖尿病、心血管病等，妊娠，吸煙，近3個(gè)月內(nèi)使用抗生素史者，患者知情同意，在術(shù)中收集新鮮且色形質(zhì)正常、無明顯炎癥的的牙齦組織。運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代HGFs 并進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞傳至5 代時(shí)將細(xì)胞接至12 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為3 組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔：①空白對(duì)照組，10%FBS 培養(yǎng)基；②2μg/mlP.gLPS+10%FBS 培養(yǎng)基刺激；③2μg/mlP.gLPS +1μg/ml APN+10%FBS 培養(yǎng)基刺激。

2.主要試劑及儀器：RT-PCR 試劑盒（sigma，美國）；引物（生工，上海）；P.gLPS（InvivoGen，美國）；APN（Peprotech，英國）。

二、方法

1.人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代，顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)法-SP 法鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為中胚層來源的人牙齦成纖維細(xì)胞，且不含上皮細(xì)胞。

2.P.gLPS 或聯(lián)合APN 刺激HGFs：取5 代HGFs 以1×105個(gè)/孔的密度均勻鋪在12 孔板上，于37℃，5% CO2溫箱孵育2 天使細(xì)胞貼壁融合至80%時(shí)，更換為1%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培育1 天（這一步作為饑餓處理使牙齦成纖維細(xì)胞在刺激因素干預(yù)后產(chǎn)生足量的細(xì)胞因子），1 天后開始刺激實(shí)驗(yàn)。根據(jù)組別在12 孔板每孔依次加入2μg/mlP.gLPS 2ml（以10%FBS 培養(yǎng)基為溶劑），4μg/mlP.gLPS 1ml+2μg/ml APN 1ml（均以10%FBS 培養(yǎng)基為溶劑），空白對(duì)照（10%FBS 培養(yǎng)基）2ml，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，于37℃，5% CO2溫箱孵育24h，棄去培養(yǎng)液，在6h，8h，24h 提取HGFs 的總mRNA。

3.real-time PCR 檢測(cè)各組HGFs 中TNF-α、IL-6、PGE2、MMP-1 的表達(dá)：Trizol 提取人牙齦成纖維細(xì)胞總RNA，super RTcDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物序列如下：IL-6（162bp）（5’-CTCAATATTAGAGTCTCAACCCCCA-3’）和（5’- AGAAGGCAACTGGACCGAAG -3’），PGE2（163bp）（5’-AGGAGGGCGCATCTCTTTTC-3’）和（5’-CCAGTGCTATGAGGTTCCCC-3’），TNF-α（163bp）（5’-CTTCTCGAACCCCGAGTGAC-3）和（5’-ATGAGGTACAGGCCCTCTGA-3’），MMP-1（179bp）（5’-ATGCACAGCTTTCCTCCACT-3’）和（5’-ACTGGGCCACTATTTCTCCG-3’），95℃預(yù)變性約5min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min，循環(huán)閾值代表mRNA 數(shù)目，以β-actin 作為內(nèi)參，2-△△ct法處理數(shù)據(jù)，與對(duì)照組進(jìn)行比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用IBM SPSS Statistics 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素ANOVA 方差分析（完全隨機(jī)設(shè)計(jì)），以P＜0.05 認(rèn)為具有顯著性差異。

結(jié)果

1.HGFs 的培養(yǎng)與鑒定：運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)HGFs，3～4 天后可見組織邊緣隱約有成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞游出，細(xì)胞極性較強(qiáng)，呈漩渦狀（圖1A）。當(dāng)細(xì)胞匯合至80～90%時(shí)，進(jìn)行首次傳代，隨培養(yǎng)時(shí)間和代數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)呈單一長(zhǎng)梭型（圖1B）。免疫組化結(jié)果顯示：細(xì)胞抗波形蛋白染色陽性（圖2A），抗角蛋白染色陰性（圖2B），證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為中胚層來源，并未混雜任何上皮源性細(xì)胞。

圖1 人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

圖2 HGFs 組織來源的鑒定（免疫組織化學(xué)SP 法）

2.real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果：①2μg/ml P.g LPS刺激HGFs 分泌PGE2、IL-6、MMP-1 及TNF-α：如圖3A、3B、3D 所示，在2μg/mlP.gLPS 刺激下HGFs 分泌PGE2、IL-6、TNF-α 在8h 時(shí)達(dá)峰值，以后逐漸減少，因此取8h 為進(jìn)一步干預(yù)實(shí)驗(yàn)PGE2、IL-6、TNF-α 的時(shí)間觀察點(diǎn)。如圖3C，MMP-1 分泌量在24h 內(nèi)隨時(shí)間遞減，因此取6h 為進(jìn)一步干預(yù)實(shí)驗(yàn)MMP-1 的時(shí)間觀察點(diǎn)。②各炎性介質(zhì)P.gLPS 最佳刺激點(diǎn)APN 對(duì)P.gLPS 刺激HGFs 分泌炎性介質(zhì)的影響：如圖4A 所示，在8h，相較于空白對(duì)照組，P.g LPS 刺激組的PGE2 表達(dá)明顯上升（P＜0.05），APN 對(duì)P.gLPS 誘導(dǎo)的PGE2 表達(dá)上調(diào)起促進(jìn)作用，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），圖4B 所示在8h，相較于空白對(duì)照組，P.gLPS 刺激組的IL-6 明顯上升（P＜0.05），APN 明顯抑制這一過程，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖4C 所示，在6h，相較于空白對(duì)照組，P.gLPS 刺激組的MMP-1 明顯上升（P＜0.05），APN 對(duì)P.gLPS 刺激的MMP-1 表達(dá)上調(diào)同樣起著抑制作用，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖4D 所示，在8h，相較于空白對(duì)照組，P.gLPS 刺激組的TNF-α 明顯上升，APN 對(duì)這一過程起促進(jìn)作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)2μg/ml P.g LPS 刺激HGFs 分泌炎性介質(zhì)A:PGE2，B:IL-6，C:MMP-1，D:TNF-α

圖4 APN 對(duì)P.g LPS 刺激HGFs 分泌炎性介質(zhì)的影響P.g LPS:2μg/ml；APN:1μg/ml，A:PGE2，8h;B:IL-6，8h；C:MMP-1，6h；D:TNF-α，8h。*代表P.g LPS+10%FBS 組與10%FBS 組組間差異P＜0.05，**代表P.g LPS+APN+10%FBS 組與P.g LPS+10%FBS 組組間差異P＜0.05

討論

牙齦成纖維細(xì)胞在牙齦炎早期即可接觸到P.gLPS，在其上有Toll 樣受體4（Toll like receptor-4，TLR4）和Toll 樣受體2（Toll like receptor-2，TLR2）的表達(dá)，P.gLPS 與牙齦成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜上的CD14 結(jié)合之后形成LPS-LBP-CD14 三體復(fù)合物，被轉(zhuǎn)運(yùn)至TLR-MD-2，最終形成白介素受體相關(guān)激酶（interleukin receptor associated kinase，IRAK）/腫瘤壞死因子相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）復(fù)合體激活TRAF6，進(jìn)而激活核因子（nuclear factor-κB，NF-κ B）和核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activated protein kinase-1，AP-1），游離的NF-κ B 被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，激活下游基因，各炎性介質(zhì)隨之產(chǎn)生[14]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)2μg/mlP.gLPS 對(duì)HGFs 分泌目標(biāo)因子作用最強(qiáng)（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚未展示）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在24h 內(nèi)，2μg/mlP.gLPS 刺激HGFs 分泌PGE2、IL-6、TNF-α 隨時(shí)間遞增，8h 達(dá)峰值，以后逐漸減少。IL-6 在0-8h 分泌量隨時(shí)間遞增，8h 達(dá)峰值，以后逐漸減少，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是：HGFs 后期產(chǎn)生大量的抑制因子IL-10 來抑制IL-6 的分泌。有研究表明該作用主要受轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B 的調(diào)控[15]。Malefyt 等[16]發(fā)現(xiàn)，在激活細(xì)胞后4-8h，單核細(xì)胞產(chǎn)生并分泌炎性因子IL-6，在8h 時(shí)才開始產(chǎn)生內(nèi)源性抗炎因子IL-10，到24～48h 達(dá)峰值。這合理解釋了8h 前IL-6 含量隨時(shí)間遞增，而在8h 達(dá)高峰后其表達(dá)反而隨時(shí)間下降。PGE2、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)呈現(xiàn)了類似的趨勢(shì)，而MMP-1 的表達(dá)則不同，在6h 其表達(dá)為峰值，隨著時(shí)間遞減。有研究[17]表明，10ug/ml LPS 刺激HGFs 后，MMP-1 的表達(dá)量在受刺激后12h 內(nèi)逐漸增加，至12h 達(dá)峰值，以后逐漸減弱。也有研究[18]表明除中性粒細(xì)胞以外，大多數(shù)細(xì)胞在受刺激后的4-8h 即可合成基質(zhì)金屬蛋白酶，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，大部分MMP-1 被釋放至胞外，而胞內(nèi)貯存的較少，這合理解釋了本研究中隨著時(shí)間遞增，MMP-1 的表達(dá)量反而下降。在對(duì)牙周炎致病機(jī)理的探索中，不同的細(xì)胞因子間相互作用，這一復(fù)雜的相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)影響著牙周病的走向，為去除某些內(nèi)源性細(xì)胞因子的干擾及其他相關(guān)因素的干擾，更好研究APN 對(duì)這四種炎癥因子的調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)對(duì)PGE2、IL-6 及TNF-α 選擇了8h 這一時(shí)間點(diǎn)，對(duì)MMP-1選擇了6h 這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行討論。本實(shí)驗(yàn)表明，P.gLPS 作為牙周病的一類強(qiáng)致病物，可以促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量的促炎因子和基質(zhì)降解酶，導(dǎo)致牙周軟硬組織的降解和炎癥的進(jìn)一步惡化，這一點(diǎn)充分強(qiáng)調(diào)了病原微生物的致病作用在牙周炎癥、組織破壞過程中不可忽視。更為重要的是，本研究表明APN 顯著抑制P.gLPS 刺激HGFs 分泌炎癥因子如IL-6 及MMP-1，這與Dominik K 的研究[13]一致，他的研究以口腔上皮細(xì)胞為研究對(duì)象。目前有研究[19]表明，APN 發(fā)揮這一作用的可能機(jī)制是：在正常情況下，未活化的NF-κ B 與它的抑制蛋白IκB 結(jié)合以維持在胞質(zhì)中一定量的NF-κ B，而當(dāng)IκB 磷酸化以及部分降解后，NF-κ B 被轉(zhuǎn)錄至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)各種炎癥因子的表達(dá)。有研究[20]表明，APN 在與脂聯(lián)素受體1/脂聯(lián)素受體2（ adiponectin receptor1/ adiponectin receptor 2，AdipoR1/R2）上的COOH 末端結(jié)合后，富集大量的APPL1 接頭蛋白至脂聯(lián)素受體的NH2 末端，大量的APPL1 活化了腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）通路，而活化的AMPK 通路又會(huì)抑制IKK-NF-κ B 通路，因此，從這個(gè)意義上來說，APN 主要是通過減少NF-κ B 向核內(nèi)轉(zhuǎn)錄抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，也有研究[19]認(rèn)為APN 也可通過抑制ERK1/2 的活性來發(fā)揮這一作用，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究表明，在P.gLPS 刺激PGE2 表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)，APN 對(duì)這一過程起促進(jìn)作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而在非最佳誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)，如6h 和24h，APN 抑制其表達(dá)（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未展示）。有研究[21]表明在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，APN 通過上調(diào)PGE2 表達(dá)發(fā)揮促炎作用，關(guān)于APN 對(duì)于PGE2 的表達(dá)調(diào)控存在爭(zhēng)議，仍需更多研究去證實(shí)。P.gLPS 刺激組的TNF-α 明顯上升，APN 對(duì)這一過程起促進(jìn)作用，但數(shù)據(jù)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而且在非最佳刺激時(shí)間點(diǎn)，如6h，APN 對(duì)其表達(dá)起抑制作用（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并未展示）。脂聯(lián)素形式多樣，大多數(shù)研究證實(shí)其作用大致類似，但仍有不少研究提示不同結(jié)果。Hong GP 研究組[22]用來自大腸桿菌和鼠骨髓瘤細(xì)胞重組的球狀A(yù)PN 刺激牙周膜細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)來自大腸桿菌的球狀A(yù)PN 可促進(jìn)炎性因子IL-6、IL-8 的分泌，多粘菌素B（一種LPS 的抑制劑）可以抑制這種作用，而來自小鼠骨髓瘤細(xì)胞的重組APN 卻沒有引起IL-6 和IL-8 的分泌增加，分析可能是前者混入有大腸桿菌脂多糖。本實(shí)驗(yàn)選取的是來自于E.coli 提取的球狀A(yù)PN，純度達(dá)99.5%，可排除因純度問題混入LPS。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)2μg/mlP.gLPS 可以較強(qiáng)地促進(jìn)HGFs 炎性因子的分泌，加入脂聯(lián)素這一干擾因素后，結(jié)果不可預(yù)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間和試劑濃度均基于Dominik K[13]的研究，同時(shí)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)來改良，但P.gLPS 刺激各炎性因子表達(dá)隨濃度、時(shí)間變化較大，結(jié)果復(fù)雜，在此主要討論P(yáng).gLPS 最佳刺激時(shí)間點(diǎn)APN 對(duì)其影響。P.gLPS作為一種高效的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，可以刺激牙齦成纖維細(xì)胞合成分泌PGE2，IL-6，MMP-1 及TNF-α，在各炎性介質(zhì)最佳刺激時(shí)間點(diǎn)，APN 可抑制P.gLPS 刺激HGFs 分泌IL-6 及MMP-1，發(fā)揮抗炎、抗骨破壞和基質(zhì)降解作用，脂聯(lián)素與這些促炎因子相互作用，使相應(yīng)的炎癥反應(yīng)減弱，低脂聯(lián)素血癥很可能是聯(lián)系牙周炎與肥胖相關(guān)性的內(nèi)在因素之一。此結(jié)論仍然需要其他方面的研究進(jìn)一步證實(shí)，從而增強(qiáng)結(jié)果的可靠性。