張樹東,周 建,田 壯,劉長振,姚 琦
骨質(zhì)疏松是老年人的常見病和多發(fā)病,嚴重影響著老年人的生活質(zhì)量。目前,與核因子κ-B配體的受體激活劑(receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand,RANKL)和骨硬化蛋白相關的免疫療法在骨質(zhì)疏松治療上取得一定進展[1-2]。我們課題組欲通過將RANKL、骨硬化蛋白與Qβ病毒樣顆粒(Qβvirus-like particles,Qβ-VLPs)交聯(lián)制備骨質(zhì)疏松相關疫苗的方式,達到防治骨質(zhì)疏松的目的。Qβ-VLPs能誘導機體的免疫應答,在疫苗領域中研究很廣泛,現(xiàn)已經(jīng)與相應抗原交聯(lián)制備出瘧疾疫苗[3]、腫瘤疫苗[4]、寨卡病毒疫苗[5]、骨質(zhì)疏松疫苗[6],并且戒煙疫苗、高血壓疫苗等已經(jīng)進入臨床試驗階段,表現(xiàn)出很好的安全性,表明Qβ-VLPs具有很大的應用于人體疫苗制備的研究潛力[7-8]。
表達并制備具有正確空間結(jié)構(gòu)且純度較高的Qβ-VLPs是將其用于后續(xù)實驗的基礎,Tatyana等[9]通過反轉(zhuǎn)錄等技術獲得編碼Qβ衣殼蛋白的基因C,并獲得電鏡下與野生型球形結(jié)構(gòu)相似的Qβ-VLPs?;駽由編碼Qβ衣殼蛋白的133個氨基酸(14 ku)和編碼通讀蛋白A1的329個氨基酸組成,A1蛋白會有部分代替衣殼蛋白單體形成180聚體顆粒[10],在形成感染性噬菌體顆粒中發(fā)揮著重要作用[11]。本課題組設計實驗進行Qβ-VLPs蛋白表達、鑒定和純化,以獲得更為安全的Qβ-VLPs。
1.1 設計 優(yōu)化病毒樣顆粒蛋白的表達及純化條件。
1.2 時間及地點 實驗于2017-06至2018-12在中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心北京市重點實驗室完成。
1.3 材料
1.3.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)均購自天根生化科技 (北京) 有限公司,查閱文獻[9]獲得Qβ衣殼蛋白的序列全長,共402 bp,編碼133個氨基酸,由北京普爾普樂生物科技有限公司克隆到載體質(zhì)粒pET-30a上,記為pET-30a-Qβ-VLPs。
1.3.2 試劑及儀器 質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司,卡那霉素、氯霉素購自北京索萊寶科技有限公司,0.45 μm濾器購自美國Millipore公司,蛋白Marker購自美國賽默飛公司,超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司,恒溫振蕩器購自上海一恒公司,AKTA avant 25蛋白層析純化系統(tǒng)和CL-4B分子篩填料購自美國GE公司。
1.4 實驗方法
1.4.1 目的質(zhì)粒的擴增及小量提取 取出合成的pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒,根據(jù)說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α中,取出適量菌液涂布到帶有卡那霉素(100 μg/ml)抗性的固體LB培養(yǎng)液上,倒置放置于37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。挑取單菌落擴增,送生物公司測序。依據(jù)小提質(zhì)粒試劑盒說明書的要求提取pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒并于-20 ℃冰箱備用。
1.4.2 Qβ-VLPs蛋白的表達和鑒定 (1)pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。預實驗過程中發(fā)現(xiàn)使用常用的原核蛋白表達菌株BL21(DE3)并不能得到具有球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs,因此本實驗使用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)三種菌株進行實驗。依據(jù)感受態(tài)說明書將pET-30a-Qβ-VLPs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到3種菌株中,然后涂布到添加有相應抗菌素的LB固體培養(yǎng)液上過夜培養(yǎng),其中BL21(DE3)菌株使用添加有卡那霉素(100 μg/ml)的固體LB培養(yǎng)液,BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)菌株使用添加有卡那霉素(100 μg/ml)+氯霉素(25 μg/ml)的固體LB培養(yǎng)液。(2)菌株的誘導表達。從過夜培養(yǎng)的固體LB培養(yǎng)液上挑取單菌落,在添加有相應抗菌素的LB培養(yǎng)液中擴增(37 ℃,220 r/min),待菌液濃度達到OD:0.6~0.8時,從3種不同的菌液中各取0.5 ml作為空白對照,然后向3種菌液中加入蛋白表達誘導劑IPTG使其終濃度為0.5 mM,在16 ℃、180 r/min條件下誘導培養(yǎng)20 h。(3)SDS-PAGE分析Qβ-VLPs蛋白。離心收集表達后的菌體,并用雙蒸水清洗菌體一次。向3種菌株誘導前、后的樣品中加入適量的還原型蛋白上樣緩沖液,在金屬浴中100 ℃加熱5 min,通過使用12%的SDS-PAGE檢測3種菌株是否能表達Qβ-VLPs的單體。(4)SDS-PAGE和透射電鏡驗證Qβ-VLPs蛋白結(jié)構(gòu)。Qβ-VLPs以180聚體的形式存在,穩(wěn)定的5-6聚體是其基本單位,能檢測出5-6聚體的存在形式,基本可確定Qβ-VLPs球形結(jié)構(gòu)的形成。取出3種誘導表達后的菌體沉淀并用超聲破碎,離心收集上清液,用非還原性蛋白電泳上樣緩沖液處理樣品,并用SDS-PAGE檢測是否形成Qβ-VLPs的5-6聚體。用5%的磷鎢酸對3種Qβ-VLPs上清液進行染色后用透射電鏡觀察是否表達出球形結(jié)構(gòu)。
1.4.3 BL21(DE3)pLysS菌株表達條件的優(yōu)化 筆者通過BL21(DE3)pLysS表達出具有球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs,然后設計實驗優(yōu)化其表達效率,IPTG在原核表達中發(fā)揮著重要作用,本次實驗設置0.2 mM和0.5 mM兩個IPTG濃度進行實驗。按上述步驟將菌體分為2組進行擴增,待菌液OD達到0.6~0.8時暫停搖床,向菌液中滴加IPTG,使得第1組工作濃度為0.2 mM,第2組工作濃度為0.5 mM,誘導表達20 h,條件為16 ℃,180 r/min。培養(yǎng)結(jié)束后超聲破碎菌體并離心收集蛋白上清液,用非還原性蛋白上樣緩沖液處理后SDS-PAGE驗證。
1.4.4 菌體破碎方式的優(yōu)化 Qβ-VLPs具有一定的空間結(jié)構(gòu),不同的菌體破碎方式對蛋白產(chǎn)量存在一定的影響,本實驗采用3種不同的菌體破碎方式進行實驗,每種方式使用等量的相同表達條件的菌體進行實驗。(1)超聲破菌:取出凍存的菌體,用10 ml的PBS沖懸后,使用超聲儀冰浴條件下破菌,超聲破菌功率300 W,破碎3 s,間歇5 s,共20 min。破碎結(jié)束后4 ℃,12 000 r/min,離心30 min,棄去沉淀,收集上清。(2)反復凍融破菌:取出凍存的菌體,室溫融化,然后向其中加入適量液氮至菌體全部凝固,室溫放置至菌體融化,然后再次加入適量液氮,重復該過程5次。操作結(jié)束后用10 ml的PBS沖懸菌體,離心取上清,棄沉淀。(3)溶菌酶裂解:用PBS溶液(含有2 mg/ml溶菌酶和0.1%Triton X 100)沖懸菌體,室溫放置30 min,間歇吹打混勻,然后用20 ml注射器反復吹打破碎菌體。操作結(jié)束后離心取上清,棄沉淀。操作結(jié)束后將得到的3組蛋白上清液用0.45 μm濾膜過濾,取適量樣品用非還原性蛋白上樣緩沖液處理后SDS-PAGE驗證實驗結(jié)果。
1.4.5 Qβ-VLPs蛋白的純化 取適量菌體超聲破菌后4 ℃,12 000 r/min,離心20 min收集上清。(1)硫酸銨聚沉:向蛋白上清液中添加硫酸銨至終濃度為20%,4 ℃層析柜靜置4 h后離心收集上清。再調(diào)整硫酸銨至終濃度為50%,4 ℃層析柜靜置過夜,離心收集沉淀,棄去上清;(2)高速離心除沉淀:將硫酸銨聚沉得到的蛋白沉淀用適量PBS溶解后高速離心,離心條件:4 ℃,20 000 r/min,離心60 min。離心結(jié)束后,收集上清液;(3)分子篩蛋白純化:將高速離心后得到的Qβ-VLPs上清液用10 kDa的濃縮管離心濃縮至1 ml,使用分子篩通過AKTA系統(tǒng)進行純化,分段收集樣品后透射電鏡和SDS-PAGE驗證結(jié)果。
2.1 不同菌株表達Qβ-VLPs結(jié)果 SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明,3種菌株均能表達Qβ衣殼蛋白單體,其中,只有BL21(DE3)pLysS菌株可以表達出具有5-6聚體的結(jié)構(gòu)(圖1,只提供BL21(DE3)pLysS菌株電泳結(jié)果)。透射電鏡觀察,只有BL21(DE3)pLysS菌株可以表達具有25~30 nm球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs(圖2)。
圖1 SDS-PAGE檢測BL21(DE3)pLysS菌株表達結(jié)果
用非還原性(non-reducing)蛋白上樣緩沖液處理樣品后,用12%的SDS-PAGE檢測樣品中Qβ病毒樣顆粒的結(jié)果。圖中箭頭分別表示單體、二聚體、五聚體和六聚體
圖2 電鏡觀察不同菌株表達Qβ-VLPs的結(jié)果
A. BL21(DE3)菌株; B. BL21(DE3)pLysS菌株; C. Rosetta(DE3)菌株
2.2 Qβ-VLPs表達條件的優(yōu)化 SDS-PAGE檢測,0.5 mM的IPTG時誘導表達效率較高,是0.2 mM的2.8倍(圖3)。
圖3 SDS-PAGE檢測不同IPTG濃度對Qβ-VLPs表達影響
設置2個不同的IPTG濃度分別對Qβ病毒樣顆粒蛋白進行誘導表達,觀察對Qβ病毒樣顆粒表達的影響。圖中a表示0.2 mM的IPTG濃度,b表示0.5 mM的IPTG濃度
2.3 菌體破碎方式對蛋白產(chǎn)量和純度的影響 超聲破碎所得蛋白產(chǎn)量是溶菌酶法的1.1倍,是反復凍融法的3.5倍(圖4)。
圖4 SDS-PAGE檢測菌體破碎方式對Qβ-VLPs蛋白產(chǎn)量的影響
2.4 Qβ-VLPs的純化結(jié)果 取破碎后分離得到的Qβ-VLPs上清液經(jīng)硫酸銨、高速離心進行初步純化,然后用分子篩分離(圖5A)。收集50~100 ml之間的蛋白用透射電鏡和SDS-PAGE檢測,可以得到純度在90%左右、電鏡下呈球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs(圖5B)。
圖5 Qβ-VLPs的純化及檢測
Qβ-VLPs具有很好的安全性和打破機體免疫耐受的功能,在疫苗研究領域具有很大的發(fā)展?jié)摿?。A1蛋白作為Qβ噬菌體中的通讀蛋白,與Qβ衣殼蛋白共用起始密碼子,可代替部分衣殼蛋白單體形成180聚體的病毒樣顆粒[10],但是,A1在形成感染性噬菌體顆粒中發(fā)揮著重要作用[11]。既能得到Qβ衣殼蛋白形成的病毒樣顆粒,又能避免A1潛在的感染性威脅,是本實驗目的之一。本實驗只把Qβ噬菌體基因C中的Qβ衣殼蛋白的基因克隆到載體質(zhì)粒pET30a上,不包含Qβ衣殼蛋白終止密碼子后的基因序列,不能合成通讀蛋白A1。筆者發(fā)現(xiàn)使用A1蛋白和Qβ衣殼蛋白二者存在的條件下表達病毒樣顆粒的方法,與僅有Qβ衣殼蛋白時組裝病毒樣顆粒的條件不同,相同的條件下僅有Qβ衣殼蛋白時無法表達出病毒樣顆粒。A1蛋白在Qβ-VLPs的形成和穩(wěn)定中可能發(fā)揮著重要作用,本實驗未做深入探討。
本研究使用3種不同的表達菌株,最終使用BL21(DE3)pLysS菌株制備出了具有球形結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs。該菌株帶有表達T7溶菌酶基因序列的pLysS質(zhì)粒,表達的T7溶菌酶可以降低目的基因的背景表達,但不干擾IPTG的誘導表達[12],攜帶有pLysS質(zhì)粒的菌株在原核表達中應用廣泛[13,14]。降低背景蛋白表達能降低菌株的負擔[15],Qβ衣殼蛋白可以自組裝形成正確空間結(jié)構(gòu),背景蛋白降低可以減弱雜蛋白對Qβ衣殼蛋白形成空間結(jié)構(gòu)的影響,有利于合成正確的空間結(jié)構(gòu)。
Qβ-VLPs是由180個衣殼蛋白單體組成的20面體結(jié)構(gòu),單體之間可以通過二硫鍵形成穩(wěn)定的5-6聚體,5-6聚體的存在可以初步驗證空間結(jié)構(gòu)的建立[16]。本實驗用SDS-PAGE驗證3種菌株表達Qβ-VLPs的結(jié)果,只有BL21(DE3)pLysS菌株可以形成5-6聚體,筆者進一步通過透射電鏡觀察3種菌株表達Qβ-VLPs的空間結(jié)構(gòu),只有BL21(DE3)pLysS形成球形結(jié)構(gòu),與5-6聚體的形成可以初步判定球形空間結(jié)構(gòu)形成的結(jié)論一致。
獲得Qβ-VLPs后,我們對其表達條件進行優(yōu)化,IPTG在蛋白的表達過程中發(fā)揮著重要作用,可以使得生長階段的菌株轉(zhuǎn)化成表達階段的菌株,而且誘導劑濃度可以顯著影響蛋白的產(chǎn)量,IPTG濃度過低會使得表達產(chǎn)量低,過高會打破菌株代謝平衡,產(chǎn)生毒性[17]。本實驗設計了0.2 mM和0.5 mM兩個IPTG的工作濃度,結(jié)果顯示,0.5 mM IPTG得到的Qβ-VLPs比0.2 mM IPTG得到的Qβ-VLPs產(chǎn)量高。
Qβ-VLPs具有復雜的空間結(jié)構(gòu),菌體的充分破碎,破碎過程對蛋白空間結(jié)構(gòu)不造成明顯影響,且破碎后的產(chǎn)物方便下一步的分離純化,是選擇病毒樣顆粒表達菌破碎方法的重要因素。本研究設計了3種不同的菌體裂解方式,超聲破碎、液氮反復凍融和溶菌酶裂解,結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復凍融法得到的蛋白產(chǎn)量較低,因為在操作過程中會產(chǎn)生大量的黏性產(chǎn)物,離心和過濾較為困難,蛋白回收效率較低。溶菌酶法和超聲破碎對Qβ-VLPs的產(chǎn)量影響較小,超聲破碎操作簡便,菌體破碎徹底,不會產(chǎn)生不易分離的黏性物質(zhì),并且超聲破碎不會引入新的雜蛋白,不會增加后續(xù)純化過程的難度,本次實驗結(jié)果所得數(shù)據(jù)傾向于使用超聲破碎法進行菌體裂解。
菌體破碎得到蛋白上清液后,本實驗先用20%和50%濃度的硫酸銨進行初步純化,然后通過高速離心進行純化,試驗過程中發(fā)現(xiàn)離子交換柱獲得Qβ-VLPs產(chǎn)量較低,損失較大。因此,本次實驗過程中取消離子交換柱純化的步驟,直接通過分子篩分選即可以得到純度較高的Qβ-VLPs。
Qβ-VLPs在納米載體領域和疫苗領域都應用廣泛,而且比其他的病毒樣顆粒穩(wěn)定[18],使得有關Qβ-VLPs的研究也更為全面。Qβ-VLPs可以激發(fā)T細胞依賴和非T細胞依賴的抗體應答,Qβ-VLPs內(nèi)的TLR(Toll-like receptor,Toll樣受體)配體可以很大程度的促進Qβ-VLPs的免疫應答,并且B細胞內(nèi)的TLR信號通路承擔此效應,因此,Qβ-VLPs成為研究B細胞TLR信號的理想抗原[19]。在疫苗領域,IL-17與Qβ-VLPs交聯(lián)制備的疫苗在治療自身免疫性炎癥性疾病時表現(xiàn)較好,對疫苗刺激機體產(chǎn)生的抗體進行分子水平的研究,發(fā)現(xiàn)自身產(chǎn)生的抗體與IL-17具有較高的親和力[20]。通過α-Gal與Qβ-VLPs交聯(lián)制備的疫苗可以對過敏反應和利什曼蟲感染產(chǎn)生一定的治療效果[21-22]。Qβ-VLPs的形成和解聚過程研究也較為充分,對Qβ衣殼蛋白解聚和組裝過程進行研究,使得對Qβ-VLPs的研究更為全面[18],也使其具有更大的潛在研究價值,本次實驗制備出更為安全的Qβ-VLPs,為Qβ-VLPs后續(xù)研究奠定一定基礎。
綜上所述,Qβ-VLPs在疫苗研究領域發(fā)揮著越來越重要的作用,本研究通過不同表達菌株獲得具有正確空間結(jié)構(gòu)的Qβ-VLPs,通過改變IPTG濃度優(yōu)化其表達條件,設置3種菌體破碎方式,依據(jù)本次實驗結(jié)果和操作過程綜合考慮選擇超聲破碎的方法,通過硫酸銨沉淀、高速離心和分子篩分選等蛋白純化方案,最終制備出產(chǎn)量和純度都較高的Qβ-VLPs,為Qβ-VLPs在骨質(zhì)疏松疫苗領域的研究和應用奠定可靠基礎。