王 菲 王允野 張 丹 趙曉茹 劉 昆

吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林吉林 132013

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年上升且呈低齡化，已成為我國乃至全球肝硬化的最主要病因之一。NAFLD 多同時伴有其他代謝性疾病，如肥胖、高脂血癥、2 型糖尿病等。目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷等機(jī)制有關(guān)[1]，臨床治療上多采用降血脂、保肝、控制飲食、運(yùn)動等方式，但患者依從性差，難以長期堅(jiān)持。近些年，多項(xiàng)研究表明NAFLD 與飲食、膽汁酸水平以及腸道菌群有密切關(guān)系[2]，通過調(diào)節(jié)飲食- 膽汁酸- 腸道菌群來治療NAFLD 是目前提出的新的治療途徑，其效果如何目前缺乏實(shí)驗(yàn)研究，本研究應(yīng)用抗生素、高脂飲食制造非酒精性脂肪肝病模型，并隨機(jī)分組給予益生菌、調(diào)節(jié)膽汁酸治療，觀察比較其療效，為NAFLD 治療方案提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2017 年9 月～2018 年4 月選取SPF 級BALB/c小鼠72 只，雌雄各半，由吉林醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重（18±2）g。頭孢曲松鈉（湖南科倫制藥有限公司，H20065642）1.0g/ 支，配成按100mg/kg 給藥。高脂飼料：82.5% 普通飼料，2% 膽固醇，10%豬油，5% 蛋黃粉、0.5% 三號膽鹽組成[3]。益生菌選用枯草桿菌二聯(lián)活菌（北京韓美公司，S20030087）。熊去氧膽酸（德國 Dr.Falk 公司，H20181059），配成10μmol/L 溶液，胃管灌入。采用全自動血清生化儀（荷蘭SelcetraXL）及南京建成生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測試。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)第一部分方法 隨機(jī)選取小鼠40 只，隨機(jī)分為四組。10 只小鼠采用普通飼料喂養(yǎng)，為Ⅰ組；10 只采用高脂飼料喂養(yǎng)，為Ⅱ組；另外選擇10只小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，并給予頭孢曲松鈉每日2 次經(jīng)口灌入，為Ⅲ組。另10 只小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，同時應(yīng)用頭孢曲松鈉每日2 次經(jīng)口灌入，為Ⅳ組。喂養(yǎng)12 周后，深度麻醉小鼠，摘眼球取血，化驗(yàn)甘油三酯、膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶、脂聯(lián)素，收集小鼠糞便應(yīng)用膽汁酸試劑盒檢測膽汁酸水平，無菌取回盲部糞便進(jìn)行腸道菌群培養(yǎng)進(jìn)行比較，處死后稱取全肝濕重并記錄，取肝組織制成10% 肝勻漿，應(yīng)用勻漿器勻漿，測定肝勻漿組織血脂成分。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)第二部分方法 根據(jù)Ⅳ組方式喂養(yǎng)小鼠32 只12 周后均停用抗生素，給予普通飲食、無菌水，將其隨機(jī)平均分為四組，每組8 只，一組為對照組，即A 組；8 只給予熊去氧膽酸，為B 組；另8只給予枯草桿菌二聯(lián)活菌經(jīng)口灌入，為C 組；其余8 只同時給予熊去氧膽酸及枯草桿菌二聯(lián)活菌，為D 組。ABCD 四組小鼠均飼養(yǎng)12 周后深度麻醉小鼠，再次化驗(yàn)上述指標(biāo)。

1.2.3 標(biāo)本采集及處理 小鼠血清生化指標(biāo)的測定：深度麻醉小鼠，摘眼球取血，將血置干燥管中，3000r/min 22℃離心10min，取上層血清，應(yīng)用全自動生化檢測儀檢測血清中TG、TC、ALT 和AST。

1.2.4 肝勻漿血脂成分測定 測定肝勻漿組織血脂成分，制備10% 肝勻漿：取小鼠肝臟0.5g，用眼科剪在冰上盡快剪碎并倒入玻璃勻漿器中，加入4.5mL 預(yù)冷的生理鹽水，將勻漿器下端插入冰水中充分研磨6 ～8min，使肝組織勻漿化。將制備好的10% 勻漿3500r/min 4℃離心10min，取上清液按同樣條件再離心10min，取上清液備用。應(yīng)用全自動生化檢測儀檢測上清液TG 和TC 含量。

1.2.5 腸道菌群定量檢測 處死小鼠后無菌條件下取其盲腸內(nèi)容物稱重，10 倍稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以下幾種培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)：乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS）；雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BS）；腸球菌選擇性培養(yǎng)基（EC）；腸桿菌選擇性培養(yǎng)基（EMB）。EC、EMB 平板均置于37℃有需氧培養(yǎng)24h 后計(jì)數(shù)；BS、LBS 平板置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48h 后計(jì)數(shù)。

1.2.6 糞便膽汁酸水平測定 收集小鼠糞便應(yīng)用膽汁酸試劑盒檢測膽汁酸水平（按說明書操作）。

表1 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平比較

表1 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平比較

注：與Ⅰ組比較，aP ＜0.01

組別 n TG（mmol/L） TC（mmol/L） ALT（IU/L） AST（IU/L） TBA（μmol/L） 脂聯(lián)素（μg/mL）糞便膽汁酸水平（mmol/g）Ⅰ組 10 3.27±0.46 0.72±0.14 33.48±1.41 51.17±7.63 5.2±1.14 2.56±0.63 20.15±2.48Ⅱ組 10 4.97±1.17a 0.69±0.83 71.9±2.34a 92.66±8.34a 9.2±2.19a 4.02±0.85a 15.68±1.75aⅢ組 10 3.69±0.77 0.70±0.13 93.95±3.01a 101.33±7.94a 5.6±2.24 2.89±0.65 19.36±1.63Ⅳ組 10 5.13±0.65a 0.73±0.16 145.1±2.07a 130.04±15.20a 11.0±3.56a 4.12±0.69a 14.25±1.23a F 12.463 2.406 538.507 235.657 9.211 17.315 23.417 P 0.000 0.083 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)

各組無死亡，Ⅰ組小鼠食欲好，毛發(fā)光澤度好，精神狀態(tài)良好，Ⅱ組小鼠體重增長明顯，Ⅲ、Ⅳ組小鼠出現(xiàn)精神萎靡不振，毛色粗糙，行動遲緩，伴有腹瀉，Ⅳ組小鼠癥狀更加明顯。

2.2 各組生化指標(biāo)比較

2.2.1 各組小鼠生化及糞便膽汁酸水平比較 Ⅱ、Ⅳ組TG、TBA、脂聯(lián)素較Ⅰ組均明顯升高，糞便膽汁酸水平明顯下降，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ALT、AST 水平均較Ⅰ組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中Ⅳ組升高最明顯。見表1。

2.2.2 各組小鼠生化及糞便膽汁酸比較 C、D 組TG、脂聯(lián)素較A 組均有明顯下降，B、D 組TBA 較A 組明顯升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B、C、D 組ALT、AST 較A 組均有明顯改善，糞便膽汁酸水平較A 組均升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），D 組相關(guān)指標(biāo)改善最明顯。見表2。

2.3 各組小鼠肝組織勻漿檢測結(jié)果分析

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TG，Ⅱ、Ⅳ組TC，與Ⅰ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B、C、D 組TG 較A 組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），D 組TC 較A 組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組肝組織勻漿血脂成分（mmol/L）

表3 各組肝組織勻漿血脂成分（mmol/L）

注：與Ⅰ組比較，aP ＜0.01，與A 組比較bP ＜0.01，cP ＜0.05

組別 n TG TCⅠ組 10 1.16±0.25 0.55±0.19Ⅱ組 10 3.09±0.18a 1.38±0.86aⅢ組 10 1.48±0.12a 0.51±0.06Ⅳ組 10 3.39±0.31a 1.45±0.37a A組 8 2.69±0.28 0.98±0.24 B組 8 1.44±0.22b 0.68±0.35 C組 8 1.86±0.13b 0.74±0.26 D組 8 1.12±0.28b 0.58±0.17c F 146.735 18.445 P 0.000 0.000

2.4 各組小鼠腸道菌群檢測結(jié)果分析

Ⅲ、Ⅳ組雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌水平較Ⅰ組下降，而腸球菌水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B、C、D 組雙歧桿菌、乳酸桿菌，C、D 腸桿菌較A 組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），B、C、D 組腸球菌與A 組比較無明顯變化。見表4。

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、全球經(jīng)濟(jì)化的推進(jìn)，人們的生存環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣等發(fā)生了巨大變化，過去人們主要死亡原因是傳染病、感染性疾病，而如今慢性非傳染性疾病發(fā)病率逐年上升。肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥等代謝性疾病躍居疾病譜前列。非酒精性脂肪性肝病是指排除飲酒、藥物、機(jī)械等損肝因素導(dǎo)致大量肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，從單純脂肪變性逐漸發(fā)展到脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化及其并發(fā)癥。NAFLD 是多種因素共同作用結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制除了飲食、環(huán)境、遺傳等因素外，還與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化、膽汁酸代謝、自噬、腸道菌群等因素有密切關(guān)系[1]。目前治療多采用保肝、飲食控制、增加運(yùn)動量等治療方法，本文通過其病因發(fā)病機(jī)制，探討通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝及腸道菌群，對NAFLD 治療的效果。

表4 各組腸道菌群定量檢測結(jié)果比較

人體腸道內(nèi)有大量微生物，稱為腸道菌群，其數(shù)量可達(dá)1014，被稱為“人體最大的器官”。腸道菌群不僅數(shù)量巨大，種類也非常豐富，是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群的主要功能包括分解碳水化合物，參與機(jī)體維生素的合成，促進(jìn)各種離子的吸收，產(chǎn)生有機(jī)酸維持腸道內(nèi)環(huán)境適合的pH 等。另外腸道菌群通過營養(yǎng)、腸道上皮細(xì)胞黏附位點(diǎn)的競爭以及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等機(jī)制發(fā)揮屏障功能，抵御外來菌的定殖。通過觀察無菌小鼠及非無菌小鼠相同食物消耗情況，體重變化，以及給無菌小鼠定植正常小鼠盲腸內(nèi)容物引起即使攝入食物少也會造成脂肪累積、血脂變化等實(shí)驗(yàn)，顯示腸道菌群在能量攝取轉(zhuǎn)化方面起重要作用[4-5]。腸道的血流經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，可使致病菌和LPS 大量移位損傷肝功能，反之肝臟功能異常，通過膽汁分泌和腸肝循環(huán)引起腸道功能紊亂，它們之間的病理生理聯(lián)系稱為“腸- 肝軸”。慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌患者降低腸道清除能力，增加外來菌的粘附機(jī)會，且影響腸道PH 值，導(dǎo)致細(xì)菌過度生長。大量研究表明，腸道菌群在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的發(fā)生中起重要作用[6]。Wigg 等[7]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)50%NASH 患者存在小腸細(xì)菌過度生長。Farhadi 等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)NASH 的發(fā)生發(fā)展與腸道通透性之間的關(guān)系。

本研究通過高脂飲食及頭孢曲松鈉誘導(dǎo)NAFLD 小鼠模型，觀察Ⅱ、Ⅳ組小鼠，TG、TBA、脂聯(lián)素均明顯升高，糞便膽汁酸水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組ALT、AST 水平均較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肝勻漿血脂成分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TG，Ⅱ、Ⅳ組TC，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示高脂飲食及抗生素可引起肝內(nèi)血脂成分顯著升高，肝臟出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，肝功轉(zhuǎn)氨酶水平升高，引起NASH。比較各組腸道菌群變化，Ⅲ、Ⅳ組雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌下降明顯，腸球菌水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)表明腸道菌群失調(diào)可加重肝臟損害。Li 等[9]應(yīng)用混合益生菌治療ob/ob 小鼠，能夠有效改善肝組織學(xué)，降低肝總脂肪酸含量，并能降低ALT 的水平，證實(shí)益生菌能夠治療NAFLD。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌后，小鼠腸道菌群改善，血脂及肝臟相關(guān)指標(biāo)也有所好轉(zhuǎn)，說明改善腸道菌群能有有效治療NAFLD。目前研究認(rèn)為，腸道菌群失調(diào)引起NAFLD 的機(jī)制：（1）增加能量攝入導(dǎo)致肥胖[4]，進(jìn)而引起一系列代謝性疾病；（2）改變腸道的通透性，產(chǎn)生低度炎癥；（3）腸道微生物有害產(chǎn)物通過“腸－肝軸”，導(dǎo)致肝損害等。此外，還認(rèn)為腸道微生物有調(diào)節(jié)飲食膽堿代謝、膽汁酸代謝[10]及增加內(nèi)源性乙醇來發(fā)揮作用。

膽汁酸是膽汁的重要組成成分，是膽固醇的終末降解產(chǎn)物，在脂肪代謝中起重要作用，且能夠調(diào)節(jié)膽固醇的水平。膽汁酸在肝臟合成后進(jìn)入膽囊，在膽囊中儲存濃縮5 ～ 10 倍，食物可引起膽囊收縮，驅(qū)動膽汁酸的腸肝循環(huán)[11]。各種形式膽汁酸在腸道發(fā)揮不同的生理功能，在腸道菌群作用下，發(fā)生轉(zhuǎn)化，并按主動運(yùn)輸或被動運(yùn)輸機(jī)理大約 95% 的膽汁酸被重吸收，只有大約5% 的膽汁酸隨食物殘?jiān)懦?，丟失的膽汁酸則通過膽汁酸的合成補(bǔ)充。膽汁酸的代謝多由核受體FXR 和G 蛋白偶聯(lián)受體TGR5 介導(dǎo)，這種作用的具體機(jī)制目前還不是很清楚，研究表明，膽汁酸除促進(jìn)脂溶性物質(zhì)消化外，還是通過直接或間接激活法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）和G 蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（G protein coupledbile acid receptor 5，TGR5）在 葡 萄糖和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[12]。目前認(rèn)為膽汁酸與高血脂、肥胖、糖尿病等代謝性疾病有著密切關(guān)系?；谀懼崮c- 肝循環(huán)，本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)胃灌注熊去氧膽酸，調(diào)節(jié)膽汁酸水平，觀察對NAFLD 小鼠肝臟的影響。觀察發(fā)現(xiàn)，熊去氧膽酸可以改善小鼠的肝臟功能及脂肪變性相關(guān)指標(biāo)。Bechmann 等[13]對113 名NAFLD 患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著體內(nèi)游離脂肪酸水平的升高，CYP7A1 和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體鈉離子/ 牛磺膽酸鹽同向轉(zhuǎn)運(yùn)器（Na+/taurocholate cotransporter，NTCP）的表達(dá)水平提高，提示膽汁酸的合成速率和血漿中的膽汁酸濃度與NAFLD 嚴(yán)重程度相關(guān)。

腸道菌群對膽汁酸的轉(zhuǎn)化必不可少，腸道細(xì)菌數(shù)量增加，刺激FXR 或TGR5 的表達(dá)，抑制膽汁酸的合成。不同腸道菌屬，也影響膽汁酸的代謝，腸道中的厚壁菌屬和放線菌屬刺激膽汁酸合成，而擬桿菌屬和變形桿菌屬則抑制膽汁酸合成。膽汁酸是一種抑菌活性物質(zhì)，能夠抑制細(xì)菌生長增殖，可以顯著影響腸道菌群的生長和組成。在膽汁淤積及終末期肝病患者中，腸道中的膽汁酸含量降低，造成細(xì)菌過度生長[14]。給予肝硬化大鼠膽汁酸，提高腸道膽汁酸濃度，會抑制腸道細(xì)菌過度生長，減少細(xì)菌移位的發(fā)生[15]。WAHLSTR?M A[16-17]等進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究表明，給無菌小鼠，接種人類腸道菌群后，可抑制小鼠膽汁酸的合成。小鼠口服1.25 ～5.00mmol/kg的膽汁酸，改變小鼠膽汁酸水平，其腸道菌群種類比例也發(fā)生變化，厚壁菌屬由54% 升高至94% ～98%，而擬桿菌和放線菌比例顯著降低[18-19]。Boulange 等[20]研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物能減少腸道膽汁酸重吸收，使糞便膽汁酸排泄增加。Degirolamo 等[21]應(yīng)用混合益生菌喂飼小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合益生菌能夠顯著增加腸道中厚壁菌屬和放線菌屬的數(shù)量，降低擬桿菌屬和變形桿菌屬的數(shù)量，增加糞便中膽汁酸的排出量，降低腸道FGF 的表達(dá)水平，提高CYP7A1 和CYP8B1 的活性，從而增加肝臟膽汁酸的產(chǎn)量。

大量動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，在腸道菌群失衡或膽汁酸代謝紊亂的情況下，腸道菌群、膽汁酸代謝和NAFLD 構(gòu)成相互影響的惡性循環(huán)。Devkota等[22] 的研究表明，飲食中的脂肪酸能夠通過改變膽汁酸池中的膽汁酸成分，進(jìn)而使腸道菌群發(fā)生改變。經(jīng)抗生素處理后腸道菌群減少，腸道膽汁酸重吸收增加，糞便中膽汁酸排泄顯著減少[23]。本實(shí)驗(yàn)給予脂肪肝小鼠益生菌和熊去氧膽酸，調(diào)節(jié)腸道菌群及膽汁酸水平，觀察表明可有效改善肝臟功能及血脂水平，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)。

總之，由于非酒精性脂肪肝的發(fā)病率增加，對其治療成為目前研究的熱點(diǎn)，有學(xué)者[17]提出肝臟-膽汁酸- 腸道微生態(tài)軸的概念，通過調(diào)節(jié)飲食- 膽汁酸- 腸道菌群來治療非酒精性脂肪肝是目前提出的新的治療途徑。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)腸道菌群及膽汁酸水平可以有效改善肝臟脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)，對非酒精脂肪肝新的治療方案提供實(shí)驗(yàn)理論支持。