王正印 尹元 陸群

血吸蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害發(fā)展中國(guó)家人民健康的重要寄生蟲(chóng)病。全球有78個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行血吸蟲(chóng)病，感染人口接近3億，其中適齡兒童約占46%［1］，為了實(shí)現(xiàn)消除血吸蟲(chóng)病的目標(biāo)，研發(fā)血吸蟲(chóng)病疫苗成為主要的發(fā)展方向之一［2］。在血吸蟲(chóng)基因工程疫苗（包括核酸疫苗）研究中，迄今已篩選出多個(gè)亞單位候選抗原，可對(duì)血吸蟲(chóng)病的防治起到一定的作用［3～5］。為了研究更有保護(hù)力的血吸蟲(chóng)疫苗，本文從血吸蟲(chóng)胰島素受體基因（Schistosoma ja-ponicuminsulin receptor-2，SJIR-2）方面著手，通過(guò)構(gòu)建SJIR-2基因的真核表達(dá)載體作為重組疫苗，以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組SJIR-2基因?qū)?93T細(xì)胞，再以Western blot的方法驗(yàn)證其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，這將為進(jìn)一步探索SJIR-2基因的重組疫苗在血吸蟲(chóng)病防治中的作用提供幫助。

材料和方法

一、材料

1.日本血吸蟲(chóng)、真核表達(dá)載體和pEGFP 293T細(xì)胞均來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)。

2.主要試劑及儀器

Lipo2000和Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，rTaq mix購(gòu)自日本TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，T4連接酶、XmaI和PstI內(nèi)切酶購(gòu)自北京NEB公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購(gòu)自北京全式金公司，鼠抗pEGFP購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

二、方法

1.RT-PCR

將日本血吸蟲(chóng)研碎，用Trizol提取日本血吸蟲(chóng)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，SJIR-2基因擴(kuò)增引物SJIR-2-F：GCTGCAGTATGCTAAATATATTGGCTCAACATG；SJIR-2-R：CCCCGGGATAAGCTAAATCTCCATTTGTAATTGTT進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性5 min，接著94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min，4℃停止，共35個(gè)循環(huán)。取5μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.PCR產(chǎn)物和載體pEGFP的酶切及純化

取pEGFP載體和PCR產(chǎn)物各10μL，用限制性?xún)?nèi)切酶PstI和XmaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收純化酶切DNA片段。

3.SJIR-2基因與pEGFP的重組與鑒定

將pEGFP載體和純化后的SJIR-2基因以1∶3的比例混合，然后加入1μL T4連接酶制成連接反應(yīng)體系，將該連接反應(yīng)體系放進(jìn)16℃溫箱孵育過(guò)夜。次日，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)內(nèi)，在卡那抗性培養(yǎng)平板上培養(yǎng)12～16 h，挑取若干單克隆放入3 mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 rpm振搖過(guò)夜，提取重組質(zhì)粒。分別采用PCR法、雙酶切法和測(cè)序法鑒定重組基因，同時(shí)進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

4.SJIR-2基因在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別將pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒和空pEGFP對(duì)照轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，具體方法如下：①取兩個(gè)1.5 mL的EP管，向兩個(gè)EP管中加入50μL Opti-MEM培養(yǎng)基，然后向其中一個(gè)EP管中加入0.8μg質(zhì)粒，向另一個(gè)EP管中加入2μL Lipofectamine 2 000，混勻后室溫靜置5 min。②將兩個(gè)EP管中的溶液混合，室溫靜置20 min。③取細(xì)胞密度在90%左右的24孔板，棄掉原有的培養(yǎng)基，向每孔加入400μL不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，將②中質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的混合液加入培養(yǎng)板孔中。④將24孔板放回37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測(cè)SJIR-2基因所編碼的蛋白表達(dá)情況。

結(jié) 果

一、目的基因SJIR-2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR法擴(kuò)增目的基因得到1575 bp的基因片段，電泳結(jié)果與預(yù)期一致（圖1）。

圖1 目的基因SJIR-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析

二、重組載體pEGFP-SJIR-2的鑒定

用PstI和XmaI雙酶切重組基因可得到2個(gè)片段，即1 575 bp處的目的基因片段和約4 700 bp處的pEGFP片段（圖2），將酶切得到的目的基因片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)與SJIR-2基因序列同源性為100%。

圖2 pEGFP-SJIR-2的PCR及雙酶切鑒定結(jié)果

三、SJIR-2蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

用LiPo 2000分別介導(dǎo)pEGFP和pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光（圖3）；Western blot檢測(cè)出目的蛋白的表達(dá)，與預(yù)測(cè)大小一致（圖4）。

圖3 熒光顯微鏡下結(jié)果

圖4 pEGFP和pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)換293T細(xì)胞SJIR-2 Western blot蛋白表達(dá)結(jié)果

討 論

研制有效的血吸蟲(chóng)病疫苗是預(yù)防和控制血吸蟲(chóng)病的必要措施之一［6］。近年來(lái)，雖然在血吸蟲(chóng)疫苗的研究方面取得了一定的成績(jī)［7］，但是至今都沒(méi)有理想的血吸蟲(chóng)疫苗問(wèn)世。葡萄糖和糖原等碳水化合物被認(rèn)為是吸蟲(chóng)重要的能量來(lái)源，葡萄糖和糖原等碳水化合物的代謝離不開(kāi)胰島素。研究表明［8］胰島素介導(dǎo)糖代謝主要是通過(guò)PI3K途徑發(fā)揮作用：胰島素首先與靶細(xì)胞表面的胰島素受體（IR）結(jié)合，激活I(lǐng)Rp的酪氨酸激酶，然后導(dǎo)致一系列IRS的磷酸化，磷酸化的IRS激活P13K，進(jìn)而引起一系列蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致胰島素的生物效應(yīng)。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)改變都可致胰島素生物效應(yīng)降低而產(chǎn)生胰島素抵抗。因?yàn)榘屑?xì)胞膜上的胰島素受體只需10%～20%與胰島素結(jié)合，便足以發(fā)揮最大生理效應(yīng)，故胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙是胰島素抵抗的主要原因［9］。血吸蟲(chóng)胰島素受體和人類(lèi)胰島素受體在配體區(qū)域有相同的結(jié)合機(jī)制，在酪氨酸激酶區(qū)域有一樣的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)加工［10］。研究表明，血吸蟲(chóng)除了能應(yīng)答自身內(nèi)在的內(nèi)分泌激素，也能接受宿主激素信號(hào)調(diào)控增殖、發(fā)育和交配［11］。日本血吸蟲(chóng)和其哺乳動(dòng)物宿主分享胰島素受體或胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的基因片段，能接受宿主激素信號(hào)調(diào)控自身的發(fā)育［12，13］。另外在血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)和成蟲(chóng)表面表達(dá)的膜蛋白是疫苗和藥物研制合理的目標(biāo)［14］，而胰島素受體就是膜蛋白，可以作為疫苗的抗原分子。本次研究成功構(gòu)建了pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒，并且驗(yàn)證了其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從而可將該重組質(zhì)粒通過(guò)一定的方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，使該基因編碼的蛋白在宿主體內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性的抗體從而達(dá)到預(yù)防和治療血吸蟲(chóng)病的目的。這些都為我們進(jìn)一步探索SJIR-2基因的重組疫苗在血吸蟲(chóng)病防治中的作用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。