王惠嫻 葉毅 徐培平 劉金元 趙昉

流行性感冒（influenza）簡稱流感，是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，具有高度的傳染性，常引起暴發(fā)流行［1］。臨床上，部分患者發(fā)病表現(xiàn)為胃腸型感冒，以惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀為特征［2，3］。有研究表明，A型流感病毒（H1N1）感染會引起小腸免疫損傷［4］。張淑靜、吳瑩等研究發(fā)現(xiàn)流感病毒H1N1感染小鼠后，存在特異性腸道病變，病變累及小腸及大腸組織［5］，說明流感病毒感染能擴(kuò)散感染到肺臟之外的組織和器官，但該結(jié)論仍存在很大的爭議。如在H1N1／2009流感病毒感染小鼠模型中，脾臟、胸腺、大腦和腸道組織中都沒有檢測到流感病毒的存在［6］，而在小腸中檢測到了禽流感病毒H5N1和H7N2病毒，人類的H1N1病毒則沒有檢測到［7］。此外，對流感病毒是否可以在肺臟以外的組織中復(fù)制和增殖，也存在一定的爭議。有研究表明H1N1病毒不能直接感染人體腸道組織并在人體腸道組織中復(fù)制［4］，而禽流感A（H5N1）病毒可直接感染人體腸道組織并在人體腸道組織中復(fù)制［8］。目前，流感病毒感染引起腸道功能損傷的原因及機(jī)制尚不十分清楚。

中醫(yī)認(rèn)為流感屬于外感溫?zé)岵》懂牐∥灰苑螢橹?，可及胃腸。病因是外感溫?zé)岵⌒?，初起時(shí)病位以肺衛(wèi)為中心，隨病程的發(fā)展，肺衛(wèi)之邪內(nèi)傳入里，即可順傳氣分，直犯肺衛(wèi)及胃腸［9］。但中藥對流感的肺腸病變是否具有確切的治療作用仍不清楚。因此，本研究擬建立小鼠甲型流感病毒性肺炎模型，檢查呼吸道流感病毒感染過程中是否存在肺腸道功能損傷，并探討加減銀翹散的干預(yù)作用。

材料與方法

一、材料

1.動物與毒株

BALB／c小鼠，雄性，13～15 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SPF級。流感病毒A／FM／1／47（H1N1）鼠肺適應(yīng)株，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒室冷凍保存。

2.藥物與試劑

乙醚購自廣州化學(xué)試劑廠（批號20180901）。ELISA酶聯(lián)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。加減銀翹散：系由銀翹散進(jìn)行化裁而來，主要由銀花、連翹、野菊花、藿香、蒼術(shù)等藥物構(gòu)成。方中以銀花、連翹、野菊花清熱解毒為君，以藿香、蒼術(shù)、茯苓、杏仁宣肺化濕為臣，生地、丹皮清熱涼血為佐，甘草調(diào)和諸藥為使。

上述方藥按劑量比例配置，根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》［10］，按體表面積換算動物給藥劑量。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.分組與造模

小鼠分正常對照組，病毒對照組及加減銀翹散組，每組各12只。在乙醚輕度麻醉下，小鼠滴鼻感染10 LD50流感病毒液。感染后2 h開始給藥，繼續(xù)給藥4 d。每天稱體重，記錄觀察毛發(fā)、活動度、大小便情況。加減銀翹散劑量為50 g／kg（生藥材），給藥容積20 mL／kg。病毒對照組給予生理鹽水，每日1次。感染后5 d，殺剖小鼠，稱體重和肺重。同時(shí)收集支氣管肺泡灌洗液、腸道沖洗液及肺、十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸、直腸進(jìn)行相應(yīng)檢查。

2.甲型流感病毒唾液酸酶（HA）抗原檢測

采用ELISA檢測肺及十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸、直腸等的流感病毒HA抗原含量。

3.sIgA檢測

按試劑盒說明書方法采用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液及腸道沖洗液sIgA水平。

4.HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析

各組小鼠于感染后5 d處死動物，小心快速摘取肺及十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸、直腸等組織于10%的福爾馬林中固定，按HE病理常規(guī)進(jìn)行。

5.細(xì)胞因子檢測

各組小鼠于感染后5 d取材，快速摘取肺及十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸、直腸等組織，加生理鹽水按1∶9比例進(jìn)行組織研磨，3 000 r／min離心10min，收集組織上清，以ELISA法檢測細(xì)胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-17）水平。

“如果沒有猜錯(cuò)，兩位就是子虛先生與烏有先生吧！純陽子虛，翠玉白衣，燭花掌天下無對；皇家烏有，李弘之師，一身點(diǎn)穴功夫深不可測，我在長安都聽說過的！”袁安說。

6.肺腸粘膜免疫功能檢測

收集肺及大小腸組織上清，ELISA法檢測Toll受體（Toll 3、4、9）及整合素（αvβ3、α4）分子水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺指數(shù)水平值、ELISA實(shí)驗(yàn)值采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠流感病毒感染后肺臟炎癥變化

病毒對照組小鼠大多在感染流感病毒3 d以后發(fā)病，出現(xiàn)聳毛，卷縮，毛無光澤，活動減少，食量減少，體重減輕，呼吸加快、短促，大便稀溏。正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥性病變。病毒對照組肺組織出現(xiàn)不同程度的炎性病變，肺泡壁大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增寬，結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)水腫，而加減銀翹散組較之較輕，與肺指數(shù)結(jié)果相一致（圖1）。

二、小鼠流感病毒感染后腸道病理變化

HE染色結(jié)果顯示，流感病毒感染小鼠大小腸均見炎癥病變，尤以回腸與結(jié)腸段最為嚴(yán)重。與正常組相比，病毒組小鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸均有不同程度的炎性病變，尤以空腸、回腸、結(jié)腸組織部位的炎性病變較重。十二指腸局部粘膜上皮細(xì)胞壞死脫落，腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞，粘膜層可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，固有層中腺體未見明顯的萎縮，周圍可見炎性細(xì)胞浸潤，粘膜下層有些水腫?？漳c局部粘膜上皮細(xì)胞壞死明顯，固有層中腺體消失，被新生的結(jié)締組織取代，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，粘膜下層結(jié)構(gòu)疏松水腫明顯?；啬c粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的壞死脫落，粘膜局部缺損，固有層中腺體消失，被結(jié)締組織取代，粘膜下層可見炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞有些壞死脫落，局部粘膜上皮層缺損，固有層腺體消失，缺失的粘膜上皮細(xì)胞被新生的結(jié)締組織取代，新生組織中可見炎性細(xì)胞浸潤。直腸粘膜上皮細(xì)胞局部絨毛上皮細(xì)胞壞死脫落，粘膜結(jié)構(gòu)破壞，粘膜層可見炎性細(xì)胞浸潤，固有層腺體結(jié)構(gòu)也發(fā)生破壞，粘膜下層結(jié)構(gòu)疏松有些水腫。加減銀翹散組炎性病變較病毒對照組炎性病變較輕，以回腸和結(jié)腸發(fā)病較為明顯（圖2）。

圖1 小鼠流感病毒感染后各組肺臟病理變化

三、小鼠流感病毒感染后肺腸組織病毒HA抗原水平變化

小鼠感染流感病毒5 d后，病毒對照組肺、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸均見有病毒HA抗原，其含量與正常對照組相比有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與病毒對照組相比，加減銀翹散組肺腸HA抗原水平明顯降低（圖3）。

圖2 小鼠感染流感病毒后腸道病理組織變化（HE，×100）

圖3 小鼠流感病毒滴鼻感染后病毒HA抗原水平變化

四、小鼠感染后肺腸組織sIgA水平變化

圖4 小鼠流感病毒滴鼻感染后肺腸組織sIgA水平變化

五、小鼠流感病毒感染后肺腸組織細(xì)胞因子水平變化

小鼠感染流感病毒第5 d，病毒對照組肺及十二指腸及空腸、回腸、直腸細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-17水平明顯升高，結(jié)腸TNF-α和IL-6水平明顯升高，與正常對照組小鼠相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，加減銀翹散能明顯降低上述組織細(xì)胞因子水平。IFN-γ水平在肺腸組織中未見明顯升高，與正常對照組小鼠相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

圖5 小鼠感染流感病毒后肺腸組織細(xì)胞因子水平變化

六、小鼠流感病毒感染后肺腸組織粘膜免疫功能的變化

小鼠感染流感病毒第5 d，病毒對照組肺及十二指腸 及 空 腸、回 腸、結(jié)腸、直腸組織中Toll受體（TLR3、TLR4、TLR9）、整合素（αvβ3、α4）分子水平明顯升高，與正常對照組小鼠相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，加減銀翹散能明顯降低上述組織中的Toll受體及整合素分子水平（圖6）。

討 論

流感患者常見有腹瀉、惡心等呼吸道外臨床表現(xiàn)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)流感病毒除了引起肺部的炎癥病變外，在小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結(jié)腸、直腸）部位均出現(xiàn)了炎癥性病變，以回腸及結(jié)腸段炎癥病變最為嚴(yán)重。流感病毒感染小鼠同時(shí)伴有食欲不振，消瘦、厭食、大便稀溏等胃腸道臨床表現(xiàn)。從中醫(yī)角度來講，“肺與大腸相表里”，肺與大腸不僅在生理上相互聯(lián)系，而且在病理上相互影響，出現(xiàn)肺病及腸或腸病及肺，肺腸之病可以相互傳變，甚至持續(xù)形成惡性循環(huán)［11］。流感屬于中醫(yī)外感熱病范疇，“外感重肺腸”是中醫(yī)藥治療的重要方法。肺主皮毛而統(tǒng)表，大腸主傳導(dǎo)化物而治理；肺為嬌臟，太陽主表，為一身之藩籬，是人體與外界的第一道屏障，最易受外界六淫之邪侵襲。肺受邪后，宣肅之職失常，從而出現(xiàn)發(fā)熱、惡寒、咳喘、噴嚏、流涕等癥狀；因肺與大腸相合，邪氣通過表里相傳，則易傳至大腸，出現(xiàn)肺熱移腸的便秘、泄瀉、大便稀溏等癥狀。故外感病癥的發(fā)病可由肺病及腸，或肺腸同病［12］。流感發(fā)病初期表現(xiàn)為肺胃蘊(yùn)邪，濕毒壅滯，肺失宣肅，而見發(fā)熱、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛；如果侵犯胃腸，則胃腸失和，氣機(jī)失降，則出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、稀水樣便；進(jìn)一步的發(fā)展則毒邪內(nèi)陷，肺氣郁閉，損傷肺絡(luò)，則見高熱、喘憋、呼吸急促，便秘等病毒性肺炎等癥狀。銀翹散系臨床治療流感類外感的常見基礎(chǔ)方藥［13，14］，我們根據(jù)流感的發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)“外感重肺腸”的理論，在臨床與實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，在銀翹散基礎(chǔ)上增加了清熱涼血、宣肺化濕解毒中藥，組成治療流感的中藥復(fù)方加減銀翹散［15～17］。方中的銀花、連翹、野菊花清熱解毒為君，以藿香、蒼術(shù)、獲苓、杏仁宣肺化濕為臣，生地、丹皮、清熱涼血為佐，甘草調(diào)和清藥為便。實(shí)驗(yàn)證明加減銀翹散能抑制流感病毒感染小鼠肺腸炎性病變，改善肺腸粘膜免疫功能。

對于流感病毒感染導(dǎo)致的腸道損傷的機(jī)制，Wang等研究未在小腸中檢測到流感病毒抗原，認(rèn)為流感病毒感染小腸炎癥是腸道菌群構(gòu)成的變化（菌群失調(diào)）介導(dǎo)了呼吸道流感病毒感染誘導(dǎo)的特異性腸道免疫損傷［4］。而我們在小腸和大腸中均檢測到甲型流感病毒HA抗原水平明顯升高，說明流感病毒可以直接感染腸道組織。本研究檢測了肺腸部位相關(guān)炎癥因子水平，肺腸組織中TNF-α，IL-6，IL-17等水平明顯升高，說明流感病毒感染引發(fā)了肺腸炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)肺腸組織中IFN-γ水平?jīng)]有明顯升高，與Wang等的研究不一致［4］。

圖6 小鼠流感病毒感染后肺腸組織粘膜免疫功能的變化

流感病毒經(jīng)呼吸道粘膜感染侵襲，?？蓪?dǎo)致流感病毒性肺炎。而腸道和支氣管肺部相關(guān)淋巴組織同屬于粘膜免疫系統(tǒng)的重要構(gòu)成部分。分泌型IgA（sIgA）是粘膜免疫系統(tǒng)抵御外來病原體侵襲的主要免疫分子。流感病毒感染常導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，并可繼發(fā)感染細(xì)菌，時(shí)常伴發(fā)胃腸道炎癥［18］。本研究表明流感病毒可抑制支氣管肺泡灌洗液及腸道沖洗液中sIgA的分泌，而加減銀翹散可提升肺腸粘膜sIgA的分泌水平。Toll樣受體家族是一種重要的模式識別受體，可通過識別病原體而啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。在肺臟和腸道組織中，許多的病原體能直接粘附或感染粘膜上皮細(xì)胞。故在流感病毒感染時(shí)，被感染的巨噬細(xì)胞能夠釋放大量的干擾素，呼吸道上皮細(xì)胞繼而會在干擾素的作用下上調(diào)其表面TLR的表達(dá)，上調(diào)的TLR對病原體的直接識別將導(dǎo)致炎癥介質(zhì)從巨大的呼吸道表面釋放出來而導(dǎo)致炎癥的爆發(fā)［19］。其中TNF-α是一種可由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的前炎癥細(xì)胞因子，它能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤與活化，并可刺激血小板活化因子、前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)合成［20］。本研究中，流感病毒感染小鼠，肺腸組織中Toll 3，4，9受體水平顯著增加，連同IL-6，IL-17，TNF-α炎癥因子水平增加，對肺腸病理炎癥帶來或加重?fù)p害。加減銀翹散治療可以降低肺腸組織Toll受體及炎癥因子水平，減輕炎癥損害。

肺與大腸之間也存在著粘膜淋巴細(xì)胞歸巢遷移的免疫相關(guān)性。粘膜淋巴細(xì)胞歸巢作為粘膜免疫重要活動之一，具有定向選擇性。粘膜淋巴細(xì)胞的這種選擇性與它表面的相關(guān)受體和粘膜部位血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的血管定居素特異性識別有關(guān)，如在粘膜特異性受體整合素α4β7等［21］。本研究發(fā)現(xiàn)流感病毒感染小鼠肺腸組織中整合素分子αvβ3，α4水平升高，相關(guān)的支氣管肺泡灌洗液及腸道沖洗液中TNF-α含量也增加，通過肺腸相關(guān)整合素和TNF-α受體結(jié)合，通過免疫細(xì)胞的定向歸巢遷移發(fā)揮炎癥相關(guān)效應(yīng)損傷。

總之，流感病毒感染能導(dǎo)致呼吸道和腸粘膜組織免疫損傷，而加減銀翹散治療能改善流感病毒感染小鼠肺腸功能損傷及炎癥病變。由于呼吸道和腸道系統(tǒng)屬于粘膜免疫系統(tǒng)的一部分，流感病毒感染不僅可通過相應(yīng)的感染細(xì)胞侵襲到腸粘膜，從而對腸道造成損害，同時(shí)也可以通過共同粘膜免疫系統(tǒng)造成肺腸損傷。腸粘膜免疫作為肺-腸軸的中心，共同影響肺和腸。此外，流感病毒感染可造成腸道菌群紊亂，腸道菌群失調(diào)常與腸道炎癥的發(fā)生有關(guān)。流感病毒PR8感染小鼠后，分段的絲狀菌和乳酸桿菌／乳球菌數(shù)量減少，腸桿菌科數(shù)量增加，流感感染通過改變腸道微生物群的組成而引起腸道損傷［22］。但呼吸道流感病毒感染引起腸道免疫損傷的具體機(jī)制仍不清楚，尚需進(jìn)一步研究。