華 蕊 吳科榜，2 管慶豐，2 張海文，2*

(1.海南大學熱帶農(nóng)林學院，海南?？?70228；2.海南大學熱帶動物繁育與營養(yǎng)學實驗室，海南?？?70228）

為了提高畜禽對飼料的利用及畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，在飼料中加入抗生素已成為普遍現(xiàn)象。但抗生素的濫用不僅容易造成動物腸道菌群紊亂，降低動物免疫力；同時由于藥物殘留問題，給畜禽、人類、環(huán)境帶來嚴重的危害[1]。近年來，將寡聚糖、益生菌、酶制劑等作為抗生素替代物已成為許多科研人員們的研究熱點[2-4]。而抗菌肽由于其具有分子量小、熱穩(wěn)定性等特點及廣譜抗菌活性、抗炎、抗腫瘤、能夠參與免疫調(diào)節(jié)等生物學功能[5]，也引起了廣泛關(guān)注。

豬源抗菌肽PR-39 屬于cathelicidins 家族，最早是由Agerberth B等從豬小腸中分離純化得到，分子量為4 719.7 Da，富含脯氨酸和精氨酸[6]。PR-39可能通過非成孔機制殺滅細菌[7-9]；Boman 等[7]經(jīng)實驗提出PR-39 的致死作用可能是通過阻止蛋白質(zhì)合成且誘導DNA 復制所需要的某些蛋白質(zhì)的降解而實現(xiàn)的；具體的殺菌機制尚未研究清楚。有文獻報道，PR-39在抗炎癥反應(yīng)[10]、創(chuàng)傷修復和促進血管再生[11]中發(fā)揮重要作用。本實驗通過測定豬源抗菌肽PR-39對常見病原菌的抑菌活性，以及其與常用抗生素的協(xié)同殺菌效應(yīng)，研究結(jié)果為PR-39的實際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，同時探究PR-39替代抗生素開發(fā)為新型飼料添加劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

革蘭氏陰性菌：大腸桿菌K12，大腸桿菌ATCC 25922，大腸桿菌O157∶H7，豬霍亂沙門氏菌CMCC 50020，鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50013，腸炎沙門氏菌CMCC 50041，銅綠假單胞菌ATCC 27853；革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌ATCC 25923，表皮葡萄球菌ATCC 12228；供試菌株來自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。實驗菌株均保存于含20%甘油冷凍管中，置于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.1.2 主要試劑

豬源抗菌肽PR-39，購自吉爾生化(上海)有限公司；阿莫西林購自江西省科達動物藥業(yè)有限公司；慶大霉素購自四川德潤通生物公司；土霉素購自山西兆益生物有限公司；硫酸鏈霉素購自江西省科達動物藥業(yè)有限公司。-80 ℃陰暗處保存。

MH 肉湯培養(yǎng)基：準確稱取21 g MH 培養(yǎng)基粉末溶解于1 L 蒸餾水中，在高壓蒸汽滅菌鍋中經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

MH 瓊脂平板培養(yǎng)基：準確稱取21 g MH 培養(yǎng)基粉末和15 g瓊脂粉末溶解于1 L蒸餾水中，在高壓蒸汽滅菌鍋中經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌懸液的制備

將-80 ℃冷凍保存的實驗菌株解凍，在MH 瓊脂平板上接種劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h；挑選瓊脂平板上的單個菌落接種到3 ml 新鮮MH肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床中以250 r/min轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)過夜；待菌液混濁后，取30 μl 混濁菌懸液轉(zhuǎn)接到3 ml 新鮮MH 肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)2～5 h，轉(zhuǎn)速為250 r/min，直至分光光度計測定600 nm波長下的OD600為0.5左右，菌懸液即可作為實驗用菌液。

1.3 豬源抗菌肽PR-39以及抗生素對常見病原菌抑菌活性的測定

1.3.1 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

將冷凍保存的PR-39抗菌肽取出，在無菌96孔板上依次稀釋為2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/ml 的PR-39 抗菌肽稀釋液；慶大霉素配制濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1 μg/ml；土霉素配制濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1 μg/ml；阿莫西林配制濃度為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1 μg/ml。

取不同濃度的藥物（PR-39 抗菌肽或抗生素）10 μl，與90 μl提前制備好的菌懸液混合。另取100 μl菌懸液作為陽性對照組，取100 μl MH肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照組。將96孔板密封于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h；觀察96 孔板底部是否有細菌沉淀產(chǎn)生，無肉眼可見細菌沉淀的最小濃度即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

取各藥物MIC 及2 倍MIC、4 倍MIC 濃度的內(nèi)容物10 μl，滴加至MH 固體培養(yǎng)基上進行涂板（每孔做三次重復），待完全吸收后，將其倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h；觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長，無菌落生長的培養(yǎng)基所對應(yīng)的最小濃度即為該藥物的最小殺菌濃度（MBC）。

1.3.2 殺菌速率的測定

取1 ml制備好的菌懸液加入到1.5 ml離心管中，再加入PR-39 抗菌肽（抗生素）原液至其最終濃度為1×MIC，同時設(shè)置空白對照（即不加PR-39 抗菌肽），于37 ℃下恒溫震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為250 r/min；在0、10、30、50、70、90、120 min時，分別從離心管中取10 μl菌懸液于無菌96 孔板中進行100、1 000、10 000 梯度稀釋；混勻并各取15 μl 菌懸液至MH 固體培養(yǎng)基上涂板，待吸收完全后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜；挑選菌落數(shù)在15～100 個的平板進行菌落計數(shù)，計算加入PR-39 抗菌肽（抗生素）時菌懸液的細菌濃度；最終以PR-39 抗菌肽作用時間點為橫坐標，每毫升菌懸液中所含細菌數(shù)（CFU）為縱坐標，繪制動態(tài)殺菌曲線。

1.3.3 豬源抗菌肽PR-39與抗生素的協(xié)同殺菌效應(yīng)

以PR-39 抗菌肽和土霉素聯(lián)用為例：分別配制2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 倍MIC 濃度的PR-39 抗菌肽和土霉素。根據(jù)6×6棋盤實驗，將PR-39橫行添加，土霉素縱列添加；在96平板孔中滴加5 μl不同濃度的藥物，同時加入90 μl菌懸液。由此，使得每一橫行孔中PR-39 的濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 倍MIC，同時每一橫行孔中土霉素濃度不變；每一縱列孔中土霉素的濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍MIC，同時每一縱列孔中PR-39的濃度不變?；旌暇鶆蛞院?，37 ℃于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24 h。做三次重復。

根據(jù)部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index, FIC index)判斷聯(lián)合藥敏實驗的效果。

式中：MICA和MICB——分別代表A、B藥物單獨用藥時的MIC值；

MICA’和MICB’——分別代表A、B兩藥聯(lián)用時各自的MIC值。

根據(jù)以下FIC index 值的范圍即可判斷PR-39與不同抗生素聯(lián)合用藥的效果。協(xié)同效應(yīng)：FIC index≤0.5 ；相加作用（部分協(xié)同）：0.5≤FIC index≤1；無關(guān)作用：1＜FIC index≤2；頡頏作用：FIC index＞2。

2 結(jié)果

2.1 PR-39 抗菌肽和不同抗生素對病原菌MIC 和MBC的測定(見表1)

表1 豬源抗菌肽PR-39和抗生素對常見病原菌MIC和MBC的測定結(jié)果

從表1可以看出，阿莫西林、土霉素、慶大霉素對常見病原菌的生長均有較好的抑制效果；PR-39抗菌肽的MIC 均在8～32 μg/ml 之間，MBC 大多在32～64 μg/ml，部分菌的MBC 未在藥物檢測濃度范圍內(nèi)。雖然PR-39抗菌肽對常規(guī)致病菌的MIC和MBC高于常見的抗生素，但其對受試的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有一定的抑菌作用，說明其具有廣譜抗菌活性。另外，PR-39 對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌這兩種革蘭氏陽性菌雖然具有一定的抑菌作用，但均未有明顯的殺菌現(xiàn)象。因此，提示豬源抗菌肽PR-39的抑菌活性可能主要針對革蘭氏陰性菌。

2.2 PR-39抗菌肽和不同抗生素殺菌速率的測定

本實驗選取革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中具有代表性的菌株——金黃色葡萄球菌ATCC 25923和大腸桿菌ATCC 25922，繪制如圖1所示的殺菌速率曲線。從圖1（A）可以看出，PR-39在120 min內(nèi)并未有效抑制金黃色葡萄球菌ATCC 25923 的生長，而土霉素和阿莫西林分別在作用10 min 和70 min 后即檢測不到金黃色葡萄球菌的菌落形成。圖1（B）顯示，PR-39 對大腸桿菌作用30 min 即檢測不到菌落形成，效果與土霉素相當；阿莫西林的作用較強，只需10 min 左右。結(jié)果表明PR-39 對金黃色葡萄球菌ATCC 25923 的抑制作用隨時間增加變化不明顯著；對大腸桿菌ATCC 25922 的抑菌作用表現(xiàn)出時間依賴性。

2.3 豬源抗菌肽PR-39與抗生素的協(xié)同殺菌效應(yīng)

豬源抗菌肽PR-39 分別與阿莫西林、硫酸鏈霉素、土霉素對金黃色葡萄球菌ATCC 25923 和大腸桿菌O157∶H7的協(xié)同殺菌效應(yīng)實驗結(jié)果如表2～表4所示，PR-39 與常用抗生素聯(lián)合使用均未有頡頏發(fā)生。PR-39 與阿莫西林或硫酸鏈霉素聯(lián)用時表現(xiàn)為協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)均小于0.5。PR-39與土霉素聯(lián)合用藥對大腸桿菌O157∶H7 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 均表現(xiàn)為部分協(xié)同（相加作用），單獨使用時其MIC是其協(xié)同作用時的MIC的2～8倍。

3 討論

圖1 PR-39抗菌肽和不同抗生素對金黃色葡萄球菌ATCC 25923（A）和大腸桿菌ATCC 25922（B）的動態(tài)殺菌曲線

表2 PR-39與阿莫西林的協(xié)同殺菌效應(yīng)

表3 PR-39與硫酸鏈霉素的協(xié)同殺菌效應(yīng)

表4 PR-39與土霉素的協(xié)同殺菌效應(yīng)

隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，細菌病已經(jīng)給養(yǎng)殖戶造成了重大的經(jīng)濟損失。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國獸用抗生素比例超過總使用量的50%?？股匾话阃ㄟ^阻斷細菌合成核酸、細胞壁、葉酸、蛋白質(zhì)等的途徑來殺滅細菌，而細菌利用耐藥因子產(chǎn)生水解酶或者鈍化酶等滅活酶分解抗生素是耐藥性產(chǎn)生的原因之一[12]。抗菌肽由于其獨特的穿膜機制或者多樣化的特異性靶點，不易誘導產(chǎn)生耐藥性；作為一種富含脯氨酸和精氨酸的嗜中性粒細胞抗菌肽，PR-39有極大潛力作為抗生素的替代品。

本實驗通過微量肉湯稀釋法測定了PR-39 對7種革蘭氏陰性菌和2 種革蘭氏陽性菌的抑菌活性，PR-39 對除銅綠假單胞菌以外的革蘭氏陰性菌抑菌效果較好，MIC 范圍大都在8～32 μg/ml 之間，MBC 范圍則集中在32～64 μg/ml，而對革蘭氏陽性菌抑菌效果差，在藥物范圍內(nèi)都沒有明顯殺菌現(xiàn)象。這與Chan 等[13]、Veldhuizen 等[14]的實驗結(jié)果一致。文獻報道與本實驗結(jié)果均表明，相比對革蘭氏陽性菌的效用，PR-39抗菌肽對革蘭氏陰性菌具有更好的抑菌效果，其機制尚不清楚?？赡苁怯捎赑R-39抗菌肽富含脯氨酸和精氨酸，其特殊結(jié)構(gòu)與細菌之間相互作用導致；也可能是細菌自身分泌一些特異性蛋白酶作用于抗菌肽，通過改變抗菌肽的結(jié)構(gòu)從而調(diào)控其抑菌活性。關(guān)于此類研究也早有文獻研究[15]，大腸桿菌內(nèi)寡肽酶B（OpdB）的過表達能夠直接影響富含脯氨酸抗菌肽的殺菌活性，體外實驗證明OpdB 能有效地切割幾種富含脯氨酸的抗菌肽的殘基，將其縮短為無活性片段。

天然的PR-39具有廣譜的抗菌活性，但對某些細菌的抑菌效果與抗生素對比仍存在差距，因此本實驗在測定抑菌活性的基礎(chǔ)上，研究了PR-39與抗生素聯(lián)合用藥的效果。適當?shù)穆?lián)合用藥既能豐富PR-39 抗菌譜，同時減少抗生素在動物生產(chǎn)中的使用、減緩細菌耐藥性的產(chǎn)生以及降低藥物對真核細胞的毒性。關(guān)于協(xié)同作用已有諸多報道，如劉倚帆等[16]研究發(fā)現(xiàn)牛源抗菌肽Lfcin B 與金霉素、Cecroprin A 具有顯著協(xié)同抑菌作用；王國棟[17]實驗證明抗菌肽PG-1 與丁胺卡那霉素、四環(huán)素聯(lián)用對大腸桿菌的抑制有協(xié)同或相加作用；李鋼等[18]也證明豬防御素和抗生素之間存在協(xié)同抑菌作用。本實驗中的結(jié)果表明PR-39 與阿莫西林、硫酸鏈霉素、土霉素聯(lián)用對畜禽常見病原菌的抑制表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用。土霉素和硫酸鏈霉素都是通過特異性地與核糖體30S 亞單位結(jié)合以抑制蛋白質(zhì)的合成來達到抑制細菌生長，阿莫西林則是通過與細菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使細菌不能利用轉(zhuǎn)肽酶合成糖肽來合成細胞壁而死亡。聯(lián)合用藥表現(xiàn)良好，可能是由于它們結(jié)合了各自的殺菌機制，使得能更有效地殺滅細菌。

PR-39與抗生素協(xié)同除耐藥和藥殘等問題以外，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用也破壞了畜禽腸道菌群與機體間的動態(tài)平衡，腸道菌群的紊亂可導致諸多疾病如自身免疫性、過敏性及細菌疾病等，甚至可通過腦-腸軸引起諸如焦慮、抑郁癥等精神疾病[19]。有研究表明PR-39 能緩解細菌感染所致的胃腸屏障功能受損，保護動物胃腸健康[20]。

4 結(jié)論

綜上所述，PR-39對畜禽常見病原菌有一定的抑制作用，并和三種抗生素之間存在協(xié)同殺菌效應(yīng)，這體現(xiàn)出PR-39 替代抗生素開發(fā)成新型飼料添加劑的極大潛力。今后可在本實驗基礎(chǔ)上，重點研究PR-39的殺菌機制以及聯(lián)用不同抗生素的相關(guān)機理，為抗菌肽在新配方飼料方案中的使用奠定更加完善的實驗基礎(chǔ)。