賀習(xí)文 李 宏 趙彩會(huì) 高勤葉 黃姣姣 李易軒 王 珊 石 巍

（1.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，陜西渭南714000；2.河北省霸州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北霸州065700）

牛至香酚是從牛至中提取的一類揮發(fā)性油，是一種抗菌、抗氧化和防腐功能的新型綠色添加劑。牛至香酚對(duì)畜禽動(dòng)物腸道細(xì)菌引起的腹瀉能起到有效的抑制作用，能夠增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，具有防腐、驅(qū)蟲、殺菌的作用[1-3]。且在動(dòng)物體內(nèi)無殘留，可長(zhǎng)期在日糧中添加使用[4-5]。

牛至香酚是由多種物質(zhì)混合而成的添加劑，其主要成分為香芹酚和百里香酚，香芹酚和百里香酚屬于同分異構(gòu)體，香芹酚中的-OH 基團(tuán)在甲基鄰位，而百里香酚的-OH 在甲基的間位，兩者的化學(xué)性質(zhì)相似。圖1、圖2為香芹酚和百里香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》中把牛至香酚歸位其他類，適用范圍為豬和家禽，規(guī)定了食用香料在養(yǎng)殖業(yè)的使用，其中香芹酚和百里香酚是應(yīng)用最為廣泛的兩種香料，在配合飼料中添加量為5～10 mg/kg。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布關(guān)于2018～2021年開展獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作的通知，明確了養(yǎng)殖業(yè)減抗和限抗的時(shí)間表。香芹酚等綠色添加劑在飼料行業(yè)優(yōu)勢(shì)逐漸明顯，應(yīng)用也越來越廣泛，本文可滿足飼料中香芹酚和百里香酚組分的監(jiān)控需要[6-7]。

圖1 香芹酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 百里香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前有關(guān)測(cè)定香芹酚和百里香酚含量的報(bào)道較少，其中較為典型的有董茂峰等[6]利用氣相色譜法測(cè)定飼料中香芹酚和百里香酚的含量，任玉琴等[8]利用高效液相色譜法測(cè)定飼料中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的含量，但未對(duì)全部飼料品種進(jìn)行試驗(yàn)，且樣品沒有凈化；竇茂鑫等[9]發(fā)表利用高效液相色譜法測(cè)定了牛至油添加劑中的香芹酚和百里香酚的含量的檢測(cè)方法。

有關(guān)文獻(xiàn)及資料表明，檢測(cè)香芹酚和牛至香酚含量的主要方法有氣相色譜法[10-12]等，高效液相色譜法比較少見。本文建立了QuEChERS-高效液相色譜法測(cè)定飼料中香芹酚和百里香酚的含量，是一種新型實(shí)用的檢測(cè)方法。

1 儀器、試劑及方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀：UltiMate 3000；十萬分之一天平：MS205DU；萬分之一天平：CP224C；離心機(jī)：H1850；渦輪混合器：XW-80A；超聲波提取儀：KQ-100DB。

1.2 試劑

香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品含量99.10%；百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品含量99.23%；乙腈：色譜純；無水乙醇：優(yōu)級(jí)純；冰乙酸：優(yōu)級(jí)純；C18吸附材料；硅酸鎂吸附材料；中性氧化鋁吸附材料；一級(jí)水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制

香芹酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品0.010 03 g 于10 ml 容量瓶中，用無水乙醇溶解至刻度，濃度為993.97 μg/ml。

百里香酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品0.012 59 g 于10 ml 容量瓶中，用無水乙醇溶解至刻度，濃度為1 249.3 μg/ml。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取上述香芹酚標(biāo)準(zhǔn)貯備1.0 ml和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.8 ml于10 ml棕色容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，混勻，濃度為100 μg/ml。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備取飼料樣品按四分法縮分，直至混合均勻，取其中約100 g樣品，用粉碎機(jī)粉碎，全部通過60目篩。

1.4.2 樣品前處理

稱取粉碎后的配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料10 g，復(fù)合預(yù)混料、維生素預(yù)混料樣品5 g（精確至0.000 1 g），置于100 ml棕色容量瓶中，加入50%乙腈水溶液70 ml，在超聲波提取儀上超聲提取20 min，取出放置冷卻至室溫，用50%乙腈水溶液定容至刻度，混勻。

1.4.3 提取液的凈化

維生素預(yù)混料的提取液通過0.45 μm 有機(jī)濾膜后直接上機(jī)測(cè)定，配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和復(fù)合預(yù)混料樣品提取液在4 000 r/min 離心5 min，取上清液5.0 ml 于10 ml 離心管中，加入0.1 g C18 吸附材料和0.1 g 硅酸鎂吸附材料，渦輪混合1 min，靜置片刻，取上清液過0.45 μm 有機(jī)濾膜后直接上機(jī)測(cè)定。

1.4.4 色譜條件

流動(dòng)相：吸取10 ml冰乙酸于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，取此溶液500 ml 與500 ml乙腈混勻；色譜柱：Hypersil GOLDTMC18(250×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取1.3 中的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ml于100 ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)（r2）達(dá)到0.999 9，證明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

香芹酚和百里香酚易溶于醇類等有機(jī)試劑，不溶于水，因此選擇流動(dòng)相時(shí)優(yōu)先考慮有機(jī)試劑，使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，由于甲醇在低波長(zhǎng)有較大吸收，出現(xiàn)溶劑峰干擾，峰型較差且干擾目標(biāo)峰，當(dāng)有機(jī)相使用乙腈時(shí)，溶劑峰消失，因此有機(jī)相選擇乙腈，在有機(jī)相和水相比例上，優(yōu)先考慮較大的有機(jī)相比例，將乙腈的比例從90%逐漸降低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈比例為50%時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間和分離效果均達(dá)到要求，因此比例確定為50%乙腈+50%水相（v+v），水相使用純水時(shí)，目標(biāo)峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，向水相中加入少量冰乙酸，拖尾峰有改善。測(cè)試不同比例的酸，結(jié)果表明，酸濃度為1%時(shí)效果最佳。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

使用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，掃描結(jié)果如圖3、圖4。

圖3 香芹酚紫外光譜圖

從圖3 和圖4 可以看出，香芹酚的最大吸收波長(zhǎng)為194.02、214.66 nm 和274.67 nm，百里香酚的最大吸收波長(zhǎng)為193.97、215.56 nm 和275.59 nm，使用194、215 nm 和275 nm 進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)194 nm 和215 nm溶劑峰很多，基線漂移程度較大，而275 nm處沒有溶劑峰干擾，且基線穩(wěn)定。因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。

2.4 柱溫的確定

圖4 百里香酚紫外光譜圖

試驗(yàn)選取了25～45 ℃一共5 個(gè)溫度點(diǎn)的測(cè)試（每隔5 ℃測(cè)試一次），25 ℃時(shí)色譜峰的分離效果最佳，但目標(biāo)峰峰寬較大，且百里香酚峰型有拖尾現(xiàn)象；30 ℃時(shí)兩峰完全分離，峰寬合理，百里香酚沒有拖尾現(xiàn)象，35 ℃及以上峰型窄，目標(biāo)峰尖銳，但兩種化合物無法達(dá)到完全分離，最終確定柱溫為30 ℃。最終條件下的標(biāo)準(zhǔn)圖譜和樣品加標(biāo)圖譜見圖5、圖6。

2.5 加標(biāo)回收及精密度

試驗(yàn)選取了五種不同類型的飼料產(chǎn)品，分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度測(cè)定，所得結(jié)果見表1。

從表1可以看出，五種不同類型的樣品加標(biāo)回收率均大于92%，回收率良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 小于5%，滿足試驗(yàn)要求。

2.6 檢出限及定量限

試驗(yàn)以3 倍S/N 值為檢出限，10 倍S/N 值為定量限，在五種不同類型的飼料中進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，通過逐漸降低加標(biāo)濃度，當(dāng)添加濃度為0.08 mg/kg 時(shí)，峰值基本為3倍S/N值，為了減小試驗(yàn)誤差，將檢出限定為0.1 mg/kg，定量限定為0.3 mg/kg。通過對(duì)最小檢出限進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，五種不同類型的飼料中添加回收率均在92%以上，結(jié)果可滿足要求。

2.7 凈化材料的選擇

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品雜峰較多，因此考慮使用凈化材料進(jìn)行凈化吸附，以此來達(dá)到更加穩(wěn)定的試驗(yàn)效果，試驗(yàn)以同組加標(biāo)樣品進(jìn)行對(duì)比，空白組為加標(biāo)樣品未經(jīng)凈化直接測(cè)定，對(duì)照組分別為加入0.1 g C18、0.1 g C18+0.1 g 硅酸鎂、0.1 g C18+0.1 g 硅酸鎂+0.1 g 中性氧化鋁，所得的試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

圖6 加標(biāo)樣品譜圖

表1 加標(biāo)回收率及精密度RSD（%，n=6）

圖7 樣品溶液凈化結(jié)果比較

從圖7 可以看出，只加入C18 作為凈化材料的樣品凈化效果不明顯，只去除掉了小部分雜質(zhì)，而加入了C18和硅酸鎂的樣品則凈化效果比較明顯，前面的雜峰明顯減少，且目標(biāo)峰處的基線穩(wěn)定，而添加了C18、硅酸鎂和中性氧化鋁的樣品凈化效果和第二組無太大變化，而且在百里香酚目標(biāo)峰后出現(xiàn)了基線上浮，綜合考慮，選擇C18 和硅酸鎂作為凈化材料效果最好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)證明，QuEChERS-高效液相色譜法測(cè)定飼料中香芹酚和百里香酚的含量數(shù)據(jù)可靠，回收率高且穩(wěn)定，檢出限和定量限低，能夠滿足大部分飼料產(chǎn)品的檢測(cè)，同時(shí)通過QuEChERS 技術(shù)的凈化[13]，使得樣品溶液更加純凈，在檢測(cè)過程中減少了雜峰的干擾，且不影響目標(biāo)物的定性和定量，是一種新的思路，此方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可以為飼料中香芹酚和百里香酚的測(cè)定提供數(shù)據(jù)參考。