楊新建 朱建晨 田 璐 王偉青 李凌燕

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442）

乳酸菌作為一種益生菌，其在維持動物消化道菌群平衡[1]、促進(jìn)動物生長生產(chǎn)性能[2]、增強(qiáng)動物免疫功能[3]、改善動物機(jī)體體質(zhì)[4]以及緩解不良應(yīng)激[5]等方面的益生功能，已被多項(xiàng)研究所證實(shí)。但是乳酸菌多為厭氧菌或兼性厭氧菌，耐受胃酸、膽汁酸的能力差，抵抗外界溫度、濕度、O2和壓力等不良條件的能力不足，同時(shí)非同源乳酸菌還存在不易定植等缺點(diǎn)，致使到達(dá)腸道的乳酸菌很難達(dá)到發(fā)揮其益生作用的數(shù)量要求（107cfu/ml）[6]。

針對上述問題，將乳酸菌微膠囊化是保護(hù)其活性和數(shù)量，發(fā)揮其益生作用的較為有效的方式。而海藻酸鈉由于其便宜、易于處理、無毒、溫和的溶膠凝膠過程、良好的生物相容性、易于在腸道破裂、形成的微囊直徑?。?～3 μm）等優(yōu)點(diǎn)[7]，適于作為包被藥物、蛋白或細(xì)胞的微膠囊壁材。但是，在低酸環(huán)境下，由于海藻酸鈉對酸敏感，其完整性易受離子和螯合劑的影響，并且形成的膠囊多孔，使其對包被的益生菌的保護(hù)作用受到嚴(yán)重制約。因此，研究人員利各種強(qiáng)化手段來提高海藻酸鈉微膠囊的保護(hù)效果。

將海藻酸鈉和其它多聚物混合后對益生菌進(jìn)行包埋是解決單獨(dú)海藻酸鈉包被所存在問題的首選方式[8]。這些多聚物多以多糖類的碳水化合物形式存在，與海藻酸鈉復(fù)合后，不但可通過填充海藻酸鈉微膠囊存在的孔徑提高對益生菌的保護(hù)作用，還可以幫助一些微量元素和代謝物進(jìn)入微膠囊，促進(jìn)微膠囊內(nèi)益生菌的存活[9]；另外，這些物質(zhì)還可作為益生元存在提高微膠囊內(nèi)的益生菌。

本研究通過前期試驗(yàn)，確定成膜性能較佳的瓜爾豆膠與海藻酸鈉組成復(fù)合壁材，對目標(biāo)菌嗜酸乳桿菌進(jìn)行包被處理。通過檢測其包被效率、粒徑大小、耐酸性、耐膽鹽以及腸道釋放等特性，評估微膠囊對目標(biāo)菌的保護(hù)性能，以期制備一種新型高效的微膠囊材料，為復(fù)合壁材微膠囊技術(shù)的應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；海藻酸鈉、瓜爾豆膠購至上海源葉生物科技有限公司；胰酶粉（4 活性單位/mg）、胃蛋白酶（≥250 活性單位/mg）購自Sigma（上海）。CaCl2（分析純）、NaCl（分析純）、NaOH（分析純）；KH2PO4（分析純）、磷酸緩沖液（PBS）、吐溫-80、豬膽鹽和鹽酸，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；魯花大豆油，購自山東魯花集團(tuán)有限公司。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備見表1。

表1 主要儀器

1.2 方法

1.2.1 海藻酸鈉與瓜爾豆膠復(fù)合壁材對目標(biāo)菌的包被

1.2.1.1 目標(biāo)菌懸浮液的制備

嗜酸乳桿菌：凍存的甘油管室溫溶化后分區(qū)劃線接種于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落，接種于50 ml 三角瓶（裝液50 ml），37 ℃靜置培養(yǎng)12 h 左右，測定其OD600，再次接種于50 ml三角瓶（裝液50 ml MRS 肉湯，接種量根據(jù)“取樣體積×OD600=50×0.1”計(jì)算而得，也即是接種后使原液OD600為0.1），37 ℃靜止培養(yǎng)12 h（1×109CFU/ml 左右），然后8 500×g、4 ℃條件下離心10 min，菌泥重懸后終濃度為3×1010CFU/ml左右。

1.2.1.2 復(fù)合壁材與目標(biāo)菌相容性

分別在MRS 肉湯培養(yǎng)基中加入2.5%海藻酸鈉、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠，然后取等量目標(biāo)菌培養(yǎng)液接種到各混合液中，相應(yīng)條件下（37 ℃厭氧或靜置）培養(yǎng)24 h，涂布MRS 瓊脂平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以考察芯壁材的生物相容性。同時(shí)，在不含壁材的MRS肉湯培養(yǎng)基中接種相同數(shù)量菌液，同等條件下培養(yǎng)作對照。

1.2.1.3 組合壁材對目標(biāo)菌的包被

采用2.5%海藻酸鈉、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠（w/v）分別作為壁材，100 ml，滅菌后，冷卻至38～40 ℃，與目標(biāo)菌菌泥（2 ml）混合，攪拌均勻后，加入到300 ml大豆油中（含有0.5%吐溫-80 (w/v)），高速攪拌20～30 min（磁力攪拌器最高轉(zhuǎn)速），直到完全乳化（2 000 r/min，10 min不分層)，然后沿器壁快速(20 ml/s)加入100 ml 0.1 mol/l 的CaCl2溶液，低速攪拌至水油兩相分離（30 min），最后，在350×g、10 min 條件下離心收集微膠囊，并用0.1 mol/l 的CaCl2溶液漂洗3 次，然后將樣品用8層紗布濾去多余水分，備用。

1.2.2 微膠囊包被效果評估

1.2.2.1 微膠囊形態(tài)觀察及粒徑分布

采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察微膠囊形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用Beckman Coulter LS2000 激光粒度分析儀測定其粒徑分布。

1.2.2.2 微膠囊包被效率的測定[10]

式中：微膠囊中活菌數(shù)量為每克濕微膠囊的含菌量與微膠囊總重量的乘積；初始活菌數(shù)量為每毫升濃縮菌液的含菌量與濃縮菌液總體積的乘積。

計(jì)數(shù)方法：取1 ml 樣液或1 g 樣品加入到9 ml 0.2 mol/l、pH值8.0的磷酸緩沖液中，37 ℃溫育10 min，然后用旋渦振蕩器（或搖床）震蕩10 min，以徹底從微膠囊中釋放目標(biāo)菌，然后用生理鹽水溶液進(jìn)行梯度稀釋至合適濃度，涂布MRS 瓊脂平板，37 ℃、24 h 左右，計(jì)算活菌數(shù)。每個(gè)樣品重復(fù)三次。

1.2.2.3 微膠囊在胃腸液中對目標(biāo)菌的保護(hù)效果評估[11]

胃液配制：取濃度為1 mol/ml 的稀鹽酸，加水稀釋，將pH 值調(diào)至1.5。每100 ml 液體中加入1 g 胃蛋白酶，混勻，用0.22 μm的無菌濾頭過濾待用。

腸液配制：取KH2PO46.8 g 加水500 ml 溶解，用0.4%（w/w)的NaOH 回調(diào)pH 值至6.8。每100 ml 液體中加入1 g 胰酶粉和2 g 的豬膽鹽，混勻，用0.22 μm的無菌濾頭過濾待用。

實(shí)驗(yàn)處理：取1 g 各種微膠囊，接入含有15 ml 胃液（pH 值1.5）的滅菌三角瓶內(nèi)（帶橡膠塞），37 ℃、110 r/min、培養(yǎng)2 h。同時(shí)，胃液培養(yǎng)結(jié)束后，取1 g各種微膠囊，接入含有15 ml 腸液的滅菌三角瓶中（pH值6.8），37 ℃、110 r/min、培養(yǎng)4 h。分別在胃液和腸液培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，按1.2.2.2 中方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，按下式進(jìn)行保護(hù)效果計(jì)算：

胃液中存活率(%)=

腸液中存活率(%)=

1.2.2.4 包衣微膠囊在胃腸液中釋放性能評估

取0.2 g各種處理微膠囊，接入含有3 ml胃液（pH值1.5）的10 ml 離心管中，37 ℃、110 r/min、厭氧培養(yǎng)2 h。胃液培養(yǎng)結(jié)束后，350×g 離心5 min，去除上清，加入3 ml 模擬腸液（pH 值6.8），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在胃液和腸液培養(yǎng)過程中，每隔30 min 取一個(gè)樣品管，測定微膠囊的溶脹性能。

方法：首先將樣品進(jìn)行350×g離心5 min，后將離心后的沉淀，倒扣在8 層滅菌紗布上，去除多余水分后，稱重，并與微膠囊初始重量相比。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010 進(jìn)行整理，利用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA 模塊進(jìn)行單因素方差分析，處理間均值采用Duncan's多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 復(fù)合壁材與目標(biāo)菌的相容性

嗜酸乳桿菌與2.5%海藻酸鈉及2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合壁材的相容性結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，無論是2.5%海藻酸鈉，還是2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠的組合，對目標(biāo)菌的生長均無影響，并且在一定程度上促進(jìn)了嗜酸乳桿菌的生長，尤其是2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠的組合，使嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)達(dá)到了(1.11±0.13)×109CFU/ml。但與對照（MRS肉湯）相比，差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 嗜酸乳桿菌與復(fù)合壁材的相容性

2.2 復(fù)合壁材微膠囊形態(tài)觀察

2.5%海藻酸鈉微膠囊、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊在電鏡下的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)圖以及表面局部圖如圖2所示。結(jié)果顯示，2.5%海藻酸鈉微膠囊和2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊均具有較好的圓形度，并且在放大500倍（圖2A左、圖2B左）情況下，兩種微膠囊的外觀結(jié)構(gòu)較為平滑和致密（表面為黏附的菌體），但2種微膠囊相比發(fā)現(xiàn)，2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊的上述幾個(gè)方面均比2.5%海藻酸鈉微膠囊更優(yōu)。同時(shí)，微膠囊表面局部圖（圖2A右、圖2B右）結(jié)果也顯示，2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊表面的孔狀結(jié)構(gòu)和致密程度對比2.5%海藻酸鈉微膠囊均有不同程度的改善。

圖2 各種微膠囊整體形態(tài)(圖2A、B左，×500)及局部形態(tài)(圖2A、B右，×20K)

2.3 復(fù)合壁材微膠囊包被率及其粒徑大小(見表2)

表2 微膠囊包被率及粒徑大小

表2 展示了2.5%海藻酸鈉微膠囊、2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊的包被率和粒徑大小。根據(jù)1.2.2.2 中公式計(jì)算所得2.5%海藻酸鈉微膠囊的包被率為（35.08±1.52）%，活菌數(shù)（荷載量）為（1.43±0.30）×109CFU/g；2.5%海藻酸鈉+0.5%瓜爾豆膠復(fù)合璧材微膠囊的包被率為（47.49±1.91）%，活菌數(shù)（荷載量）為（1.78±0.44）×109CFU/g。二者相比，差異顯著（P＜0.05）。

粒徑大小方面，由于瓜爾豆膠的加入，復(fù)合壁材微膠囊的直徑平均值[(733.01±4.00) μm]顯著高于2.5%海藻酸鈉微膠囊[(434.71±9.54) μm]（P＜0.05）。

2.4 微膠囊包被目標(biāo)菌在模擬胃腸液中的存活性能（見圖3、圖4）

根據(jù)圖3 所示，未包被嗜酸乳桿菌在模擬胃液（pH 值1.5）中作用2 h 后，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)已無法檢測到，存活率為0；而用2.5%海藻酸鈉作為壁材包被的目標(biāo)菌經(jīng)模擬胃液作用2 h 后，存活率為（0.07±0.01）%，活菌數(shù)已不足106CFU/g，但與未包被組相比，差異極顯著（P＜0.01）；復(fù)合壁材包被的目標(biāo)菌經(jīng)模擬胃液作用2 h后，存活率達(dá)到（0.47±0.02）%，活菌數(shù)達(dá)到8.32×106CFU/g，與2.5%海藻酸鈉組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 展示的是三種處理的目標(biāo)菌在模擬腸液中作用4 h后的存活率。未包被嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)已無法檢測到，存活率為0；而用2.5%海藻酸鈉作為壁材包被的目標(biāo)菌經(jīng)模擬腸液作用后，存活率為（0.16±0.03）%，活菌數(shù)為2.31×106CFU/g，與未包被組相比，差異極顯著（P＜0.01）；復(fù)合壁材包被的目標(biāo)菌經(jīng)模擬腸液作用后，存活率達(dá)到（0.54±0.01）%，活菌數(shù)接近107CFU/g，與2.5%海藻酸鈉組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖3 不同處理的嗜酸乳桿菌在模擬胃液中2 h的存活率

圖4 不同處理的嗜酸乳桿菌在模擬腸液中4 h的存活率

2.5 復(fù)合壁材微膠囊在模擬胃腸液中的釋放性能（見圖5）

圖5 展示了兩種微膠囊在模擬胃腸液中溶脹性能的變化趨勢。結(jié)果顯示，2.5%海藻酸鈉微膠囊和復(fù)合壁材微膠囊進(jìn)入胃液后，溶脹度快速提升，但最大溶脹點(diǎn)分別發(fā)生在進(jìn)入腸液后的1 h 和2 h，隨后則快速下降。

3 分析討論

3.1 復(fù)合壁材對微膠囊物理狀態(tài)的影響

微膠囊技術(shù)是提高乳酸菌及其制劑抗逆能力、發(fā)揮其益生特性的有效措施。海藻酸鈉也因?yàn)槠洫?dú)特的優(yōu)勢成為微膠囊的常用壁材，但有研究表明，因?yàn)楹Ｔ逅徕c微膠囊的多孔性和對酸性條件的敏感，使其對乳酸菌在酸性條件下的存活能力的提高產(chǎn)生阻礙[12]。

圖5 兩種微膠囊在模擬胃腸液中的溶脹性能

本研究利用具有良好溶解性、黏性、成凝膠特性以及低酸條件下（pH 值3.5 以下）的成膜特性的瓜爾豆膠與海藻酸鈉組成復(fù)合壁材，包被嗜酸乳桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是外部整體結(jié)構(gòu)還是局部形態(tài)，復(fù)合璧材微膠囊表面的孔狀結(jié)構(gòu)和致密程度比2.5%海藻酸鈉微膠囊均有不同程度的改善（圖2）。這其中原因主要是，瓜爾豆膠含有許多活性基團(tuán)（羥基），能夠和很多物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)（醚化和酯化反應(yīng)），生成相應(yīng)的化合物并形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[13]，賦予瓜爾豆膠具有較好的成膜特性，再加上瓜爾豆膠的黏性，使其能夠有效填充海藻酸鈉形成的孔狀結(jié)構(gòu)，并使微膠囊表面有序致密[14]。一些與瓜爾豆膠具有類似性質(zhì)的物質(zhì)，如槐豆膠，也已被證實(shí)可以和海藻酸鈉復(fù)合形成微膠囊，提高對目標(biāo)菌的保護(hù)作用[15]。

包被率和粒徑方面，根據(jù)表2結(jié)果可知，由于瓜爾豆膠的加入，復(fù)合壁材微膠囊包被率和平均粒徑均顯著提高(P＜0.05)。其原因可能與瓜爾豆膠的黏附性有關(guān)，因?yàn)楣蠣柖鼓z的主要成分是非離子型半乳甘露聚糖，具有較好水溶性，且在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下呈現(xiàn)很高的黏度。由于黏度的增加，使壁材對目標(biāo)菌的黏附能力增強(qiáng)，提高包被率；同樣也是因?yàn)轲ざ鹊脑黾?，同樣的攪拌轉(zhuǎn)速對于凝膠分子的分散能力減弱，致使粒徑較大。類似的結(jié)果也被趙萌等(2015)[16]的研究結(jié)果所證實(shí)。

3.2 復(fù)合壁材對微膠囊包被目標(biāo)菌生物活性的影響

微膠囊對目標(biāo)菌的生物活性的影響主要包括兩方面，一是是否對包被目標(biāo)菌抵抗胃酸和腸膽鹽的能力有促進(jìn)作用，二是能否在目標(biāo)菌發(fā)揮功能特性位點(diǎn)及時(shí)崩解，釋放目標(biāo)菌。

圖3 和圖4 的結(jié)果表明，復(fù)合壁材微膠囊對嗜酸乳桿菌抵抗低酸、膽鹽等不利條件的能力具有明顯的促進(jìn)作用，與另兩組結(jié)果相比差異極顯著（P＜0.01）。這說明，瓜爾豆膠的加入有效彌補(bǔ)了海藻酸鈉微膠囊多孔的缺陷，減少了胃酸、膽鹽等不利條件對嗜酸乳桿菌的活性的影響，進(jìn)而提高了嗜酸乳桿菌通過胃腸不利環(huán)境，到達(dá)發(fā)揮功能位點(diǎn)的能力。同時(shí)，瓜爾豆膠作為一種水溶性膳食纖維，進(jìn)入腸道后，可以進(jìn)一步發(fā)揮相應(yīng)的生物活性，如促進(jìn)體外、體內(nèi)（大腸）有益菌群的增加[17-18]，促進(jìn)中短鏈脂肪酸產(chǎn)生[19]等，保護(hù)腸道健康。本研究也得到了類似的結(jié)果（圖1），但由于加入量較少（0.5%）的原因，對目標(biāo)菌活性的促進(jìn)效果組間差異不顯著（P＞0.05）。

溶脹性能是評估微膠囊的釋放性能的常用指標(biāo)之一[20]。一般認(rèn)為，微膠囊溶脹程度越高，崩解速度就越慢，包被的目標(biāo)菌的釋放速度就越慢，微膠囊的釋放性能就越差。據(jù)圖5可知，2.5%海藻酸鈉微膠囊和復(fù)合壁材微膠囊分別在進(jìn)入腸液后的1 h 和2 h達(dá)到最大溶脹點(diǎn)，也即是在此處達(dá)到最大釋放性能。二者相比，2.5%海藻酸鈉微膠囊比復(fù)合壁材微膠囊具有更佳的腸溶性能，這可能和瓜爾豆膠能夠與海藻酸鈉形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。但是，由于2.5%海藻酸鈉在胃液中對目標(biāo)菌不能提供較好的保護(hù)作用，因此到達(dá)腸液后，也無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的益生功能；然而，復(fù)合壁材微膠囊雖然最大釋放點(diǎn)比2.5%海藻酸鈉微膠囊延遲1 h，根據(jù)Cook等（2012）[21]的觀點(diǎn)，食物在小腸中停留的時(shí)間大約為(3.2±1.6) h，因此進(jìn)入腸道2 h達(dá)到最大釋放，并不影響目標(biāo)菌功能特性的發(fā)揮。

4 結(jié)論

利用具有較好生物相容性的瓜爾豆膠與海藻酸鈉組成復(fù)合壁材，包被嗜酸乳桿菌，不但有效改善了微膠囊的外觀結(jié)構(gòu)、包被率，更重要的是，在不影響嗜酸乳桿菌在腸道中及時(shí)釋放情況下，顯著促進(jìn)了嗜酸乳桿菌抵抗胃液低酸環(huán)境、腸道膽鹽作用等不利條件的能力，增強(qiáng)了其耐受性和存活率，為嗜酸乳桿菌生物功能的發(fā)揮提供了保證，也為本研究成果的未來應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。