張灣 劉高虹 于為民 王艷紅 張楠 吳之敬 任小軍

1山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院腎內(nèi)科（太原030032）；2山西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科（太原030012）；3山西醫(yī)科大學(xué)微生物和免疫教研室（太原030001）

中國成年人慢性腎臟病的總患病率為10.8%，慢性腎臟病患者近1.2 億［1］。腎小管間質(zhì)纖維化（TIF）是各種慢性腎臟病進展至終末期腎病的最終通路。腎TIF 主要病理過程包括炎癥細(xì)胞浸潤、肌成纖維細(xì)胞（MFB）活化、細(xì)胞外基質(zhì)積累和微血管減少［2］。其中MFB 是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。以往研究［3］顯示，MFB 主要由基底成纖維細(xì)胞、血管周細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。新近研究［4-5］表明，內(nèi)皮細(xì)胞也可經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EndMT）促進纖維化的發(fā)生，并被認(rèn)為是MFB 的生成機制之一。LEBLEU 等［6］的研究發(fā)現(xiàn)纖維化腎臟中內(nèi)皮來源的MFB 和上皮細(xì)胞來源分別占10%、5%，而骨髓來源和基底成纖維細(xì)胞分別占35%、50%。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族與EndMT 的發(fā)生密切相關(guān)［7］。研究［8］顯示，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β2 已被證明能夠刺激EndMT；ACT A 是TGF-β超家族成員之一，與TGF-β亞基約有20%氨基酸序列一致，參與調(diào)控細(xì)胞生理過程。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，ACT A 在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的小管上皮細(xì)胞表達(dá)明顯增加［9］。體外實驗證實，ACT A 可刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞分泌α-SMA 和纖維連接蛋白（FN），而使用FS 阻斷ACT A 的作用后，α-SMA 和FN 表達(dá)明顯減少。提示ACT A 可通過誘導(dǎo)EMT，促進腎臟TIF 的形成［10］。ACT A 與腎臟EndMT 是否存在一定的聯(lián)系，目前還未見相關(guān)報道。

本研究運用經(jīng)典的體外培養(yǎng)的成人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）代替腎小管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察HUVEC 在ACT A 的作用下α-SMA、VECad 和FN 的表達(dá)以及FS 的干預(yù)作用，并以TGF-β 2 作為對照，探討ACT A 在EndMT 過程中的作用及可能機制，為臨床腎臟TIF 發(fā)病機理及防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑HUVEC 細(xì)胞株（山西醫(yī)科大學(xué)微生物免疫實驗室），DMEM 低糖培養(yǎng)基（美國Hyclon），胎牛血清（杭州四季青），TGF-β2（美國Peprotech），Activin A（美國Peprotech），兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（英國Abcam），兔抗纖維連接蛋白多克隆抗體（英國Abcam），兔抗VE-Cad 多克隆抗體（美國CST），兔抗actin 多克隆抗體（美國CST），通用型二步法免疫組化試劑盒（北京中山金橋），DAB 顯色試劑盒（博士德）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代取HUVEC 細(xì)胞采用DMEM 培養(yǎng)基+ 10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2的條件下生長，倒置顯微鏡下觀察。2 ～3 d 換液1 次。待貼壁細(xì)胞長到大約80%融合時，0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 消化傳代，傳至3 ～5 代時換到無胎牛血清的培養(yǎng)基中培育24 h，讓細(xì)胞進行同步化生長，再進行各指標(biāo)檢測。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖率消化指數(shù)生長期HUVEC 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105/mL，每孔200 μL 接種于96 孔板培養(yǎng)板上，培養(yǎng)48 h 后，分別加入含不同濃度ACT A（0、10、30、60、100 mg/mL）培養(yǎng)液200 μL（A 組），含不同濃度（0、10、30、60、100 ng/mL）的FS 培養(yǎng)液（F 組），30 ng/mL ACT A + 不同濃度（10、30、60、100 ng/mL）的FS 培養(yǎng)液（A + F 組），再培養(yǎng)72 h。將各濃度組都設(shè)置5 個復(fù)孔。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL，即0.5%MTT）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的OD值，細(xì)胞增殖率= 實驗組OD值/對照組OD值。

1.2.3 細(xì)胞分組將HUVEC 細(xì)胞分為5 組：（1）對照組：ACT A 及rh-FS 濃度均為0 ng/mL；（2）TGF-β組（T 組）：TGF-β2 濃度為10 ng/mL；（3）ACT A 組（A 組）：ACT A 濃度30 ng/mL；（4）TGF-β + FS 組：TGF-β2 濃度：10 ng/mL，rh-FS 濃度：100 ng/mL；（5）ACT A+FS組（A+F組）：rh-FS濃度為100 ng/mL，ACT A 濃度：30 ng/mL。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測各組細(xì)胞α-SMA、VE-Cad 和FN 蛋白表型情況HUVEC 細(xì)胞按照分組接種于鋪有蓋玻片的六孔板中，爬片處理72 h 后，4%多聚甲醛室溫固定20 min，洗滌后加入0.1% Triton-X100，室溫作用20 min 破膜，PBS 洗滌后滴加兔抗α-SMA 單克隆抗體、兔抗VE-Cad 多克隆抗體和兔抗FN 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌后滴加對應(yīng)二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）、DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞漿出現(xiàn)棕黃色并高出背景，胞核呈深藍(lán)色為陽性染色，隨機于采取5 個不連續(xù)的視野（400 ×），觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，拍照采集圖片，采用Image Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行半定量分析，計算出HUVEC 細(xì)胞α-SMA、VE-Cad 和FN 的平均光密度（mean optical density，MOD），即α-SMA、VE-Cad和FN 的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot印跡檢測α-SMA、VE-Cad、FN蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞于離心管中，加入150 μL裂解混合液（RIPA∶PMSF = 100∶1），冰浴30 min后，12 000 r/min 離心10 min 取上清，在金屬浴中煮沸變性，冷卻后加入等體積buffer，用BCA 法檢測蛋白含量。然后于8%分離膠和10%濃縮膠聚丙烯酰胺凝膠中電泳，切出分離膠，于電轉(zhuǎn)模轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，放入5%脫脂奶粉中，于室溫下封閉2 h，TBST 洗膜后分別加入α-SMA、VE-Cad、FN 多克隆抗體（1∶1 000），4 ℃下?lián)u床培養(yǎng)隔夜，收回一抗，洗膜后加入羊抗兔二抗（1∶5 000）培育2 h，洗膜后加入ECL 顯色液在凝膠成像系統(tǒng)曝光。目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異比較采用方差分析和獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACT A、FS 對HUVEC 細(xì)胞增殖率的變化ACT A 對HUVEC 細(xì)胞生長有明顯的促進作用，在30 ng/mL 促增殖作用最強，當(dāng)濃度達(dá)到100 ng/mL時，促進細(xì)胞增生的作用反而減弱（F =22.768，P＜0.001）；單獨給予FS 對細(xì)胞增生無明顯影響（F =0.437，P= 0.781）；但FS 能拮抗ACT A 對內(nèi)皮細(xì)胞生長的促進作用，呈劑量依賴性（F =15.270，P＜0.001），見圖1。

圖1 不同濃度ACT A 和FS 對細(xì)胞增殖率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of ACT A and FS on cell proliferation

2.2.ACT A 和TGF-β對HUVEC 細(xì)胞形態(tài)的影響對照組細(xì)胞呈紡錘狀，實驗組ACT A 和TGFβ 作用細(xì)胞72 h 后細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)細(xì)微變化，細(xì)胞形態(tài)明顯變?yōu)殚L梭形；TGF-β + FS 組與TGFβ 組比較細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；ACT A + FS 組與ACT A 組細(xì)胞比較，ACT A 這種效應(yīng)可被抑制，見圖2。

圖2 各組細(xì)胞形態(tài)變化（免疫細(xì)胞化學(xué)染色法，400×）Fig.2 Morphological changes of cells in each group（immunohistochemical staining，400×）

2.3 ACT A 誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞表型變化細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示，ACT A 組刺激細(xì)胞48 h 后與對照組相比，α-SMA 和FN 表達(dá)水平升高（tα-SMA=-4.988，P= 0.002；tFN= -7.407，P＜0.001），而VECad 的表達(dá)減少（tVE-Cad= 2.820，P= 0.03）；TGF-β +rh-FS 組與TGF-β 組比較細(xì)胞表型無明顯變化（tα-SMA= 1.185，P= 0.057 5；tFN= -1.042，P= 0.338；tVE-Cad= -1.743，P= 0.132）；ACT A + rhFS 組與ACT A 組細(xì)胞比較，α-SMA 和FN 表達(dá)水平降低（tα-SMA=4.440，P= 0.004；tFN= 5.455，P= 0.002），VE-Cad 的表達(dá)增加（tVE-Cad= -3.396，P= 0.015），見圖3。

圖3 各組α-SMA、VE-Cad 和FN 蛋白MOD 值比較Fig.3 Comparison of MOD values of α-SMA，VE-Cad and FN proteins in each group

2.4 Western Blot 印跡法檢測細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA、VE-Cad 和FN 的表達(dá)水平結(jié)果顯示，ACT A 組細(xì)胞的α-SMA、FN 水平較對照組明顯增高（tα-SMA= -11.363，P＜0.001；tFN= -8.381，P＜0.001），而VE-Cad 蛋白的水平較對照組有下降趨勢（tVE-Cad=5.378，P＜0.001），ACT A + FS 組α-SMA 和FN 的水平與ACT A 組比較有下降趨勢（tα-SMA= 3.898，P=0.03；tFN= 4.174，P= 0.002），TGF-β + FS 組α-SMA和FN 的水平與TGF-β 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（tα-SMA= 0.934，P= 0.372；tFN= 1.049，P= 0.319；tVE-Cad= -2.132，P= 0.059），見圖4。

3 討論

腎臟血管系統(tǒng)是調(diào)節(jié)腎臟功能的必要條件。腎小管周圍毛細(xì)血管網(wǎng)是腎小球的重要供氧結(jié)構(gòu)，其功能改變可促進腎臟疾病進展。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)一組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物包括VE-cad、CD31、血管性血友病因子和細(xì)胞角蛋白等。病理條件下，內(nèi)皮細(xì)胞可通過EndMT 促進疾病的發(fā)生。EndMT 過程中，內(nèi)皮細(xì)胞失去附著力和標(biāo)志蛋白，形成具有遷移性、細(xì)長狀間充質(zhì)樣細(xì)胞，獲得間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，如α-SMA、FSP-1、FN、波形蛋白、膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型、巢蛋白等［4，11］。內(nèi)皮細(xì)胞的表型經(jīng)過轉(zhuǎn)分化可同時含有內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞屬性。

圖4 各組α-SMA、VE-Cad 和FN 蛋白相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of alpha-SMA，VE-Cad and FN proteins in each group

EndMT 首先在胚胎心臟發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)［4］。在成年生物體中，損傷、炎癥或老化等病理條件都可以激活EndMT 并誘導(dǎo)相關(guān)器官的纖維化，如心臟、腎臟、肺、肝臟、角膜及腸道纖維化的發(fā) 生 發(fā) 展［12-13］。EndMT與腎臟TIF關(guān)系密切。ZEISBERG 等［14］在小鼠腎TIF 的研究證實，大約30% ～50%的成纖維細(xì)胞共表達(dá)CD31、成纖維特異性蛋白（FSP-1）和α-SMA，提示EndMT 與TIF 關(guān)系密切。用Tie2-Cre 追蹤小鼠內(nèi)皮細(xì)胞實驗進一步證實存在EndMT 衍生的MFB。LI 等［15］在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病腎病動物模型證實，腎小管間質(zhì)有大量表達(dá)α-SMA 陽性的內(nèi)皮來源的細(xì)胞，提示End-MT 促進早期糖尿病腎臟纖維化的發(fā)生。

TGF-β 超家族參與了EndMT 的調(diào)節(jié)，其包括3個主要成員：TGF-β、骨形成蛋白（BMP）和激活素（ACT）。已有研究顯示，TGF-β2 能夠刺激EndMT，TGF-β2 基因敲除小鼠消除了胚胎的EndMT，而TGF-β1 或TGF-β3 基因敲除小鼠沒有明顯影響EndMT 的發(fā)生過程［9］。BMP-7 主要在遠(yuǎn)端集合管和成人腎臟的腎小球足細(xì)胞表達(dá)，在腎小管間質(zhì)纖維化損傷區(qū)中表達(dá)減少。研究［16］證實，TGF-β激活Smad-2/3 信號誘導(dǎo)EndMT 的過程中，BMP-7可通過與特定受體結(jié)合，促進Smad-1/5/8 的磷酸化，發(fā)揮拮抗TGF-β信號通路的作用，因此BMP-7可能對EndMT 的抑制發(fā)揮作用。

ACT A 與組織纖維化關(guān)系密切。ACT A 異常分泌，可以引起組織細(xì)胞分化、增殖及代謝異常等［17-19］。有研究［20］發(fā)現(xiàn)ACT A 在人動脈粥樣硬化斑塊和新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞中表達(dá)增加，尤其是進展中的粥樣病變血管。也有研究［21］發(fā)現(xiàn)，ACTA及它的特異性抑制劑FS 失衡則會促發(fā)心肌梗死后心肌纖維化，ACT A 促進肌細(xì)胞增殖和內(nèi)細(xì)胞的遷移，ACT A-Smad 2/3 通路在糖尿病胚胎的心肌畸形形成中也發(fā)揮重要作用。在肝纖維化和肺纖維化模型中，ACT A 表達(dá)均上調(diào)［17，22］。也有研究［23］證實，ACT A 可刺激腎臟和胰腺的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，ACT A 與ACT 受體在腎缺血后表達(dá)增加，而腎小管細(xì)胞的FS 在缺血后其表達(dá)顯著減少。研究［24］發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ACT A 的表達(dá)增加，并降低內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ACT A 可誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生EndMT，F(xiàn)S 可通過阻斷ACT A 的效應(yīng)產(chǎn)生抑制EndMT 和抗纖維化作用。靶向ACT 可能是抑制腎TIF，延緩腎臟病進展的有效途徑。但本研究還有很多局限。首先由于技術(shù)原因，本研究采用HUVEC 代替原代培養(yǎng)的腎小管管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。其次，進一步在動物體內(nèi)實驗及開展相關(guān)臨床研究驗證本研究的結(jié)論也是必須的。最后，ACT A 促進EndMT 的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍需進一步研究證實。