張 健, 呂蒙蒙, 謝亞聰, 武憶寒, 林思祖, 陳 宇

(1.福建農(nóng)林大學林學院；2.國家林業(yè)和草原局杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002)

植物多酚又稱植物單寧，是植物次級代謝產(chǎn)生的一種天然有機化合物，廣泛存在于植物體的各組織中[1].多酚類成分具有抗氧化活性[2]、抗菌[3]、抗病毒、抗微生物、調(diào)血脂和降血糖[4-9]的作用；具有抗脂質(zhì)化作用[10]、增強抗氧化性能力等生物學作用[11].因此，植物多酚被開發(fā)應用于醫(yī)療保健[12]、化妝品[13]、食品保鮮[14-15]、建筑功能材料[16]等諸多領域.近些年隨著多酚提取方法的不斷發(fā)展，先后有諸多學者對甘薯[17]、蘋果[18]、青莢[19]、梨[20]、雞桑[21]等植物的葉進行了多酚提取工藝優(yōu)化研究，為不同植物資源的綜合利用提供了研究思路.

杉木[Cunninghamialanceolata(Hook.) Lamb.]為中國長江、秦嶺以南地區(qū)用材栽培最廣樹種[22].杉木資源利用目前主要集中在木材方面，而其非木質(zhì)利用方面研究相對匱乏，鮮有學者對其種鱗進行了多酚的提取方法及工藝優(yōu)化研究[23].隨著生態(tài)建設中杉木人工林培育面積和區(qū)域不斷擴大，在其撫育、間伐[24-25]過程中產(chǎn)生大量剩余樹葉，剩余物巨大，如何利用這些剩余物資源，豐富杉木人工林產(chǎn)品種類，提高杉木綜合利用效率，對于促進杉木人工林總體產(chǎn)值提升具有重要意義.而開展杉木葉片多酚最佳提取工藝的研究是開發(fā)杉木資源潛在價值的有效手段之一.因此，本研究以杉木葉片為原料，采用超聲波微波萃取協(xié)同輔助提取多酚，通過響應面試驗優(yōu)化其工藝參數(shù)，以期為杉木葉片中的多酚產(chǎn)業(yè)開發(fā)及杉木綜合資源的利用提供一定的研究基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料為2018年2月至7月在福建省三明市尤溪國有林場撫育、間伐、采伐及實驗采樣后的杉木廢棄葉片，保鮮處理后帶回實驗室，冷凍干燥36 h，用粉碎機粉碎后，過篩(100目)后收集至密封袋，置于4 ℃冰箱備用.

藥品(分析純)：沒食子酸(20180809,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無水乙醇(20180806,上海國藥集團化學試劑有限公司)；無水碳酸鈉(20151216,上海國藥集團化學試劑有限公司)；福林酚試劑(20180812,北京索萊寶科技有限公司).

儀器：FT102微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，CP224C奧豪斯電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；Xinyi-1000Q超聲波微波協(xié)同萃取儀(寧波新藝超聲設備有限公司)；Infinite?200 Pro NanoQuant酶標儀(Tecan Austria GmbH)； HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；PD-1E冷凍干燥機(北京德天佑科技發(fā)展有限公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的建立 精確稱量沒食子酸標品0.025 g后，超純水溶解，定容至100 mL，制備得0.25 mg·mL-1的沒食子酸標準液.采用福林酚試劑法[23]，按梯度精確遞增吸取一定量的0.25 mg·mL-1的沒食子酸標準液，制備0.25、0.20、0.15、0.10、0.05和0 mg·mL-1的標液.依次按梯度取0.2 mL不同濃度標液于6個10 mL棕色離心管內(nèi)，再加入0.4 mL福林酚試劑，震蕩搖勻，5 min后依次加入2 mL 10% Na2CO3溶液，取超純水2.4 mL定容至5 mL，震蕩搖勻，50 ℃水浴1 h，然后在765 nm波長處分別測得吸光度值[23].根據(jù)吸光度值與濃度的關系,線性回歸后得方程為y=2.830 9x+0.058 6,R2=0.999 3.

1.2.2 杉木葉片多酚提取量的測定 稱取一定的杉木混合葉片后加入既定濃度的乙醇溶液，在不同條件下進行超聲萃取后，經(jīng)真空過濾后得到葉片提取液.將其稀釋一定倍數(shù)后取0.2 mL于10 mL棕色離心管內(nèi)，依照1.2.1福林酚試劑法測定多酚步驟于可見光分區(qū)765 nm處測其吸光值.以沒食子酸標準品計算樣品中的多酚含量，計算公式如下：

式中：V為提取液體積(mL)；M為原樣質(zhì)量(g)；A為原液液稀釋后測得的吸光值；N為提取液稀釋倍數(shù)；P為多酚提取量(mg·g-1).

1.2.3 單因素試驗 稱取0.5 g杉木葉片粉末，微波功率固定150 W，進行單因素試驗，以多酚提取量為考察指標，考察各個因素.各單因素條件分別為提取時間10、15、20、25、35 min，乙醇濃度20%、40%、60%、80%、100%，液料比(一定濃度的乙醇體積與杉木混合葉片質(zhì)量比值)60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1，提取溫度30、40、50、60 、70 ℃和超聲波功率100、200、300、400、500 W.

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗設計 在1.2.3試驗的基礎上，選定提取時間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取溫度(D)為因子、多酚提取量(P)為響應值，建立4因素3水平的響應面試驗方案，29個試驗，每次試驗重復3次經(jīng)分析回歸擬合后得到回歸方程，理論預測試驗方案及多酚提取量理論值.杉木葉片的響應面因素及水平設計見表1.

表1 杉木葉片響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface test for Chinese fir leaves

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016分析處理后，在其試驗結果基礎上，用 Design-expert 10設計及處理分析，制圖.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知，在設定的單因素的取值范圍內(nèi)，杉木葉片多酚提取量均為先升后降趨勢.提取時間30 min時，多酚提取量最高(43.33 mg·g-1)，比最低水平提升了10.68%(圖1a)；提取溫度40 ℃時，多酚提取量最高(43.80 mg·g-1)，比最低水平提升了20.93%(圖1b)；乙醇濃度60%時，多酚提取量最高(45.65mg·g-1)，比最低水平提升了26.89%(圖1c)；當液料比為90∶1時，多酚提取量最高(49.30 mg·g-1)，比最低水平提升了23.25%(圖1d)；超聲波功率對杉木葉片多酚提取量無明顯影響(圖1e),在保證多酚提取量的前提下，為節(jié)約能耗，降低儀器損耗，將超聲功率固定為100 W.

圖1 各因素對多酚提取量的影響Fig.1 Effects of factors on polyphenols yields

2.2 Box-Behnken試驗結果與分析

2.2.1 回歸數(shù)學模型的建立與分析 采用Design-expert 10軟件進行響應面(Box-Behnken) 試驗設計，結果如表2所示.該試驗共設計29個試驗點，設5個零點以及24個分析因點，其中的自變量為分析因點，取值(以單因素結果為基礎)于提取時間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)及溫度(D)中所構成的三維頂點，零點提取時間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取溫度(D)的中心點，為保證試驗重復性，點試驗進行3次，以降低不可控因素對試驗的干擾.

表2 響應面試驗結果1)Table 2 Results of response surface test

1)表中最終值為3次重復試驗的均值.

表2數(shù)據(jù)用軟件進行回歸方程擬合，得到多酚提取量理論預測值(Y)與提取時間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、溫度(D)的回歸模型方程:

Y=74.24-3.17A-1.51B+3.31C-0.46D+0.04AB-0.02AC+1.25AD+4.61BC+6.60BD+7.5CD+8.26A2-

4.77B2-0.025C2-5.22D2

對該模型進行方差分析，比較各因素作用大小，分析如表3.數(shù)字模型方程(P<0.01)極顯著，其決定系數(shù)(R2)為0.819,Radj2=0.637為調(diào)整后系數(shù),可見該模型擬合性較好，失擬性P=0.064 2，差異不顯著(P>0.05)，變異系數(shù)CV=3.920%,可知該回歸方程擬合度較高，試驗誤差小，置信度較高，試驗可重復性較高.其中A、C、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、D2差異不顯著，D、C2差異顯著，B、AB差異極顯著，從表3的顯著性和F值可知，影響杉木葉片多酚提取量的因素依次為液料比(B)>提取溫度(D)>乙醇濃度(C)>提取時間(A).

表3 回歸方程顯著性檢驗表1)Table 3 Significance testing for the regression equations

1)*表明P>0.05差異不顯著,**表明P<0.05差異顯著,***表明P<0.01差異極顯著.

2.2.2 響應曲面圖分析 圖2為多酚提取量(響應值)與各個因子之間的響應曲面.圖2a、2c為提取時間與液料比、溫度的之間的交互作用對杉木葉片多酚提取量的影響結果，當提取時間在25～35 min之間時，多酚提取量均有下降趨勢.提取時間與乙醇濃度交互作用對杉木葉片多酚提取量的影響結果如圖2b所示,多酚提取量先緩慢上升后趨于平緩.圖2c、2e、2f為提取溫度與其他因素的交互作用對杉木葉片多酚提取量的影響結果，當提取溫度在30～50 ℃之間時，多酚提取量均呈上升趨勢.乙醇濃度與剩余因素之間的交互作用結果如圖2b、2d、2f所示，當乙醇濃度在50%～70%之間時，多酚提取量先是緩慢上升然后呈下降趨勢，響應面坡度變化較大.圖2a、2d、2e為液料比與其他3個因素的交互作用結果,當液料比在70∶1～110∶1之間，多酚提取量均呈上升趨勢，其響應面坡度變化的幅度極大.

2.3 最佳理論工藝及驗證性試驗

運用軟件得出的模型方程進行最佳理論試驗模擬后，得杉木葉片的最佳提取工藝：提取時間35 min，液料比110∶1，乙醇濃度61.50%，提取溫度50 ℃，理論預測多酚提取量為68.97 mg·g-1.重復6次最佳工藝，實際測得多酚平均量為62.72 mg·g-1，低于理論值10%，實測值與理論值相差較小，說明此模型較為準確可靠，具有實際操作可行性(表4).在保證提取量的基礎上，應簡化試驗操作，迎合試驗操作.因此提取工藝改良為：提取時間35 min，液料比110∶1，乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃.在該條件下重復6次，測得多酚平均得率為 62.92 mg·g-1，高于最佳工藝值0.32%，適用于實際試驗操作.

3 討論

本研究運用Box-Behnken的試驗原理，探討以杉木葉片為試驗材料，采用超聲波提取法提取多酚的最佳工藝及其優(yōu)化，得到其最佳工藝條件：提取時間35 min，液料比110∶1，乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃.在單因素處理的結果中，超聲功率的單因素試驗結果表明其對杉木葉片多酚提取影響不大，且多酚得率在超聲功率增大后有略微下降，推測其因“空化效應”增強，導致已提取出的多酚結構遭到破壞，從而多酚得率下降[26-27].提取溫度對杉木葉片多酚提取率影響的機理是：提取溫度升高，分子運動加快，多酚析出增加，加速了乙醇揮發(fā)，同時多酚結構被破壞，導致多酚得率降低[28-29].其次，加大液料比，延長提取時間，均屬于變相增大接觸面積和延長時間促進溶質(zhì)析出；乙醇濃度在一定范圍內(nèi)變化，有利于多酚與蛋白質(zhì)等結合的氫鍵破壞，但超限后會導致提取液中醇性雜質(zhì)增多，進而使多酚提取率有所降低[30-31].

圖2 不同組合變量與多酚提取量的關系響應曲面Fig.2 Response surface map of pairwise combinations of variables and polyphenol yields

類型重復次數(shù)多酚提取量mg·g-1均值mg·g-1方差相對標準偏差%類型重復次數(shù)多酚提取量mg·g-1均值mg·g-1方差相對標準偏差%最佳工藝162.1662.722.070.02試驗工藝162.6362.923.320.03262.16263.22361.82365.88461.43461.72565.33560.67663.40663.40

目前已在較多物種中開展關于利用植物采伐剩余物提取多酚的研究.相較于玉米苞葉(3.72 mg·g-1)[32]、枇杷葉(48.24 mg·g-1)[33]、甘薯葉(15.80 mg·g-1)[34]、黃芩葉(4.99 mg·g-1)[35]等，杉木葉片的多酚得率較高(62.92 mg·g-1).李佳等[23]利用杉木種子園中收種后的剩余球果進行多酚提取，其多酚得率為34.30 mg·g-1，低于本研究中葉片的多酚得率 62.92 mg·g-1，推測與鱗片的含水率較高和提取方法不同有關.從本研究的結果看，杉木葉片中含有較為豐富的植物多酚資源，具有良好的應用前景.