柯 野, 謝 濤, 衛(wèi)孟瑤, 樊銀鳳, 余 健

(韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

蛋白酶是非常重要的工業(yè)酶制劑之一，占有全球整個(gè)工業(yè)酶使用量的60%以上；堿性蛋白酶制劑又占整個(gè)蛋白酶制劑的一半以上，廣泛應(yīng)用于皮革、食品和醫(yī)藥等多種領(lǐng)域；目前商品化應(yīng)用最為廣泛的堿性蛋白酶制劑大部分來(lái)源于植物和細(xì)菌，較少來(lái)源于霉菌[1].在食品工業(yè)中，利用固態(tài)發(fā)酵霉菌產(chǎn)生的蛋白酶水解大豆制備的傳統(tǒng)食品，具有口感豐富、風(fēng)味濃郁、生理活性多樣的特點(diǎn)，備受消費(fèi)者喜愛(ài)[2].

醬油曲霉(Aspergillussojae)是傳統(tǒng)食品發(fā)酵(如豆腐乳、米酒、醬油等)的重要菌種之一，該菌能產(chǎn)生多種酶類，如蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶等[3-4].在所產(chǎn)生的酶中，堿性蛋白酶對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味、水解產(chǎn)物的脫苦味起關(guān)鍵作用[5-6].目前對(duì)該堿性蛋白酶的異源表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道.本課題組在前期的研究中已對(duì)醬油曲霉堿性蛋白酶(alkaline protease, Ap)基因在畢赤酵母中成功地進(jìn)行了異源表達(dá)，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究報(bào)道[7].該酶的體外穩(wěn)定性較差，通過(guò)分子定向進(jìn)化增強(qiáng)其穩(wěn)定性，是其工業(yè)化應(yīng)用的前提.對(duì)于提高酶穩(wěn)定性而言，增加二硫鍵用以提高酶熱穩(wěn)定性是方法之一，有研究表明[8]，增加米赫根毛霉脂肪酶中的二硫鍵，可提高該酶的熱穩(wěn)定性；同時(shí)酶結(jié)合金屬離子提高熱穩(wěn)定性和抗水解性也是備受大家關(guān)注的[9-10].本研究在前期基礎(chǔ)上，通過(guò)理性設(shè)計(jì)和定點(diǎn)突變技術(shù)，致力于探究通過(guò)增加二硫鍵和Ca2+結(jié)合殘基提高Ap穩(wěn)定性，為其工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、酶和試劑 野生型Ap的重組工程菌株和Escherichia.coliDH 5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供；表達(dá)載體pPIC9K和畢赤酵母(Pichiapastoris) KM71菌株購(gòu)自Invitrogen公司.TaKaRa MutanBEST Kit、PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司.其他化學(xué)試劑均分析純.

1.1.2 培養(yǎng)基E.coliDH 5α菌株采用LB 培養(yǎng)液培養(yǎng)，酵母轉(zhuǎn)化子采用MD平板篩選，酵母菌采用YPD培養(yǎng)液培養(yǎng)，酵母工程菌株采用BMGY和BMMY培養(yǎng)液誘導(dǎo)表達(dá).

1.1.3 各種引物 Ap基因的表達(dá)引物(P1和P2)和定點(diǎn)突變引物的序列見(jiàn)表1，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供.

表1 各種引物序列1)Table 1 Primers sequences

1)單下劃線為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；雙下劃線為6×His tag；斜體加粗為定點(diǎn)突變位點(diǎn).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Ap基因序列及其空間結(jié)構(gòu)的分析 采用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)Ap信號(hào)肽預(yù)測(cè)、SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)對(duì)Ap同源建模、Discovery studio 2.5軟件和Swiss-Pdb Viewer 4.0.3等軟件分析Ap序列和結(jié)構(gòu).

1.2.2 突變位點(diǎn)的選擇 以Ap的3-D結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ)，利用Disulfide by Design(Version 1.20)軟件對(duì)Ap中能形成二硫鍵的殘基位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；結(jié)合模板3f7o.1.A與AP氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果，以及3f7o.1.A自身形成二硫鍵的殘基位點(diǎn)，篩選出Ap中能形成二硫鍵的最大可能性的殘基位點(diǎn).

分析3f7o.1.A中Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基，確定Ca2+結(jié)合的具體原子，再以Ap的3-D結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，對(duì)Ap和3f7o.1.A中空間結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的比對(duì)，預(yù)測(cè)Ap結(jié)構(gòu)中與Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基.

1.2.3 定點(diǎn)突變的方法 利用TaKaRa MutanBEST Kit定點(diǎn)突變?cè)噭┖校凑赵噭┖猩系牟僮髦笇?dǎo)進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后將突變基因送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序確認(rèn).

1.2.4 突變基因在畢赤酵母中的異源表達(dá) 分別用表達(dá)引物P1和P2對(duì)T179G、D200G、T179G-D200G、G32C-S125C、S178C-T252C、G32C-S125C/S178C-T252C突變基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后的PCR產(chǎn)物連接至pPIC9K表達(dá)載體上，化轉(zhuǎn)至E.coliDH5α中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，SacⅠ酶線性化，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母KM71菌株中，MD平板培養(yǎng)篩選重組菌株，提取該菌株的基因組，基因組PCR鑒定突變基因整合至畢赤酵母基因組中的情況.將陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子接種至裝有50 mL BMGY的500 mL三角瓶中培養(yǎng)2～3 d后，轉(zhuǎn)接至裝有50 mL BMMY的500 mL三角瓶中，每24 h向BMMY中添加1.0%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7 d后，8 000g離心5 min收集上清液，測(cè)定酶活性和SDS-PAGE電泳鑒定后，放置4 ℃?zhèn)溆?

1.2.5 Ap的分離純化及熱穩(wěn)定性的測(cè)定 對(duì)Ap的純化采用以下步驟：向1.2.4獲得的上清液中，分級(jí)添加硫酸銨固體至飽和度為85%，4 ℃鹽析過(guò)夜后，10 000 r·min-1離心10 min，收集蛋白沉淀.用緩沖液溶解蛋白沉淀，透析過(guò)夜獲得粗酶液后，用鎳柱(HisTrap FF 5 mL, GE healthcare) 進(jìn)行親和層析，然后Sephadex G-75進(jìn)行分子篩層析收集洗脫液、濃縮獲得重組Ap.

酶活性測(cè)定法，將純化的Ap和底物的混合反應(yīng)體系置于不同的反應(yīng)溫度中，測(cè)定其相應(yīng)的酶活，用以探究反應(yīng)溫度.將Ap放置于不同的溫度水浴中，處理不同時(shí)間后，測(cè)定殘余酶活，以探究熱穩(wěn)定性；將未進(jìn)行熱處理的酶液作為對(duì)照，定義其相對(duì)酶活性為100%.

1.2.6 酶活性的測(cè)定 測(cè)定Ap的活性參考文獻(xiàn)[7]中的酶活性測(cè)定法.

2 結(jié)果與分析

2.1 Ap的3-D結(jié)構(gòu)分析

Ap肽鏈由403個(gè)氨基酸殘基組成，1～20氨基酸殘基序列是信號(hào)肽，21～121氨基酸殘基序列是前導(dǎo)肽，122～403氨基酸殘基序列是成熟肽，該酶是K型胞外蛋白酶.Ap的3-D結(jié)構(gòu)未見(jiàn)報(bào)道，Ap成熟肽與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中3f7o.1.A(來(lái)源于Paecilomyceslilacinus)的同源性高達(dá)53.79%[9]，根據(jù)同源性達(dá)到30%以上就可建模的理論，Ap以3f7o.1.A為3-D結(jié)構(gòu)模板，采用Ramachandran對(duì)主鏈ψ和φ角的合理性分析，結(jié)果表明模擬的Ap結(jié)構(gòu)合理(圖1).預(yù)測(cè)Ap的3-D結(jié)構(gòu)是其肽鏈124～402序列，便于下文敘述，以該結(jié)構(gòu)的第1個(gè)氨基酸殘基序號(hào)(Ap肽鏈中124位點(diǎn)氨基酸殘基)定義為1，余下序號(hào)以此類推.由圖1可見(jiàn)，Ap為單體酶，包括7個(gè)α螺旋、2個(gè)310-螺旋和15個(gè)β折疊，活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)分別是D39/H70/S226.在3F7O.1中有1個(gè)Ca2+結(jié)合，結(jié)合殘基分別為Glu177、Val180、Leu201主鏈中的羰基氧，以及T182側(cè)鏈基團(tuán)O1和D203側(cè)鏈基團(tuán)的O2.Ap和3f7o.1.A的Ca2+結(jié)合空間結(jié)構(gòu)，與圖2相比可知，在Ap中與Ca2+結(jié)合的殘基為A174、A177、V198、T179和D200，T179和D200位點(diǎn)的氨基酸殘基非常保守，由于T和D的側(cè)鏈O基團(tuán)對(duì)Ca2+結(jié)合作用尤為重要.在模板3F7O.1中具有5個(gè)C殘基，其中4個(gè)C殘基(即C126-C36和C181-C253)之間分別形成了2對(duì)二硫鍵；而Ap中無(wú)C殘基，無(wú)二硫鍵形成.

圖1 Ap的3-D結(jié)構(gòu)模型
Fig.1 3-D structure model of Ap

圖2 Ap(黑色)和3f7o.1.A(紅色)中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的對(duì)比分析
Fig.2 Comparative analysis of the Ca2+binding sites between Ap (black) and 3f7o.1.A (red)

2.2 突變位點(diǎn)的確定以及定點(diǎn)突變結(jié)果

利用Disulfide by Design軟件預(yù)測(cè)Ap中可能形成二硫鍵的氨基酸殘基共56對(duì)(表2)，結(jié)合模板3f7o.1中二硫鍵的形成情況，Ap中最有可能形成二硫鍵的氨基酸殘基為34～123和78～252.對(duì)該4個(gè)殘基進(jìn)行突變，獲得Y34C-R123C、L178C-T252C、Y34C-R123C/L178C-T252C共3個(gè)突變基因，測(cè)序確認(rèn)突變成功.

據(jù)2.1中Ap結(jié)構(gòu)分析，Ap的2個(gè)殘基T179和D200的側(cè)鏈基團(tuán)O與Ca2+結(jié)合；將該2個(gè)殘基分別突變?yōu)闊o(wú)側(cè)鏈基團(tuán)的G殘基，共獲得3個(gè)突變基因，即T179G、D200G、以及T179G/D200G的突變基因，測(cè)序確認(rèn)突變成功.

表2 運(yùn)用Disulfide by Design軟件預(yù)測(cè)在Ap形成二硫鍵的氨基酸殘基對(duì)Table 2 Predictions of amino acid residue pairs forming disulfide bonds in Ap using Disulfide by Design software

2.3 二硫鍵突變對(duì)Ap的影響

Y34C-R123C、L178C-T252C突變型均能在重組工程菌株中成功表達(dá)，分泌到發(fā)酵液中；突變型與野生型的發(fā)酵液中的酶活性差異不顯著，這表明增加1個(gè)二硫鍵對(duì)Ap表達(dá)不影響.

Y34C-R123C/L178C-T252C突變型不能在重組工程菌株中成功表達(dá)，這可能與Ap的折疊過(guò)程相關(guān).由于蛋白質(zhì)在成熟折疊過(guò)程中，一級(jí)肽鏈結(jié)構(gòu)中相距越近的半胱氨酸殘基間，越易形成巰基組合的分子異構(gòu)體，這種異構(gòu)體又促進(jìn)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步折疊，但該異構(gòu)體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)再折疊后，構(gòu)象有序性獲得加強(qiáng)，致使巰基組合解開，僅有接近天然構(gòu)象的柔性巰基才能靠近，形成正常天然的二硫鍵，再促使蛋白質(zhì)的正確折疊，形成穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)[11-12].Y34C-R123C、L178C-T252C突變型均能表達(dá)，但是Y34C-R123C/L178C-T252C突變型不能表達(dá)，這可能是由于R123C和L178C殘基在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相距較近，形成了錯(cuò)誤的巰基異構(gòu)體，但野生型Ap中沒(méi)有二硫鍵，導(dǎo)致該巰基結(jié)合不能斷裂，致使Ap不能進(jìn)行進(jìn)一步的正確折疊，導(dǎo)致降解不能被成功表達(dá).

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物;1:發(fā)酵上清液;2:鎳柱親和層析洗脫液;3:凝膠層析洗脫液.圖3 重組Ap的電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant Ap

分別將野生型Ap、Y34C-R123C和L178C-T252C突變型從發(fā)酵液中鹽析沉淀出，鎳柱親和層析、Sephadex G-75的分子篩層析后，獲得電泳級(jí)純度(圖3).

對(duì)野生型、Y34C-R123C和L178C-T252C突變型Ap的反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較探究.由圖4可知，3種酶雖然最適反應(yīng)溫度均為45 ℃，但Y34C-R123C突變型在50 ℃和55 ℃的反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活均高于野生型和L178C-T252C突變型；進(jìn)一步對(duì)熱穩(wěn)定性比較，圖5可見(jiàn)，Y34C-R123C突變型在40 ℃處理100 min后殘余酶活(約56%)高于野生型(約34%)的殘余酶活性22%，通過(guò)反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性結(jié)果可見(jiàn)，Y34C-R123C突變型結(jié)構(gòu)中，形成了二硫鍵結(jié)構(gòu)提高了Ap的穩(wěn)定性；由圖1可見(jiàn)R123殘基位于連接二級(jí)結(jié)構(gòu)的LOOP環(huán)上，Y34處于Ap的無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)，通過(guò)C34-C123形成的二硫鍵增強(qiáng)了Ap該無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高了Ap的耐熱性；該結(jié)果與楊倩等報(bào)道相似，即對(duì)米根霉的α-淀粉酶，采用增加氫鍵來(lái)提高酶中無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)域的穩(wěn)定性后，提高了該酶的熱穩(wěn)定性[13].

L178C-T252C突變型在反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性方面都表現(xiàn)出弱于野生型.這可能由于L178和T252殘基分別在相對(duì)較為剛性的β折疊和α螺旋上，C178-C252間形成了二硫鍵，對(duì)β折疊和α螺旋結(jié)構(gòu)有一定的影響，導(dǎo)致突變型Ap的熱穩(wěn)定性降低.

2.4 Ca2+結(jié)合殘基突變對(duì)Ap的影響

3個(gè)Ca2+結(jié)合殘基的突變型基因(T179G、D200G、T179G/D200G)在工程菌株的發(fā)酵液中都未檢測(cè)酶活性，并且發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖譜中也未有相應(yīng)的重組蛋白酶條帶，這表明3種突變型的Ap均不能在重組畢赤酵母菌株中成功表達(dá).該結(jié)果與2.1中Ap結(jié)構(gòu)分析一致，這表明T179、D200殘基的側(cè)鏈O對(duì)Ca2+的結(jié)合至關(guān)重要.

圖4 重組Ap野生型和突變型的最適反應(yīng)溫度
Fig.4 Effects of different reaction temperature on the
recombinant Ap and mutants

“—”野生型;“┄”Y34C-R123C突變型;“…”L178C-T252C突變型.
圖5 重組Ap野生型和突變型的熱穩(wěn)定性
Fig.5 Thermostability of the recombinant Ap and mutants

金屬離子對(duì)酶活性質(zhì)的影響研究較受大家的關(guān)注，有研究表明[14-15]位于α-淀粉酶BLA的結(jié)構(gòu)域A、C之間的鈣離子結(jié)合，對(duì)維持BLA穩(wěn)定性非常重要.在α-淀粉酶中增加Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，得到了在80 ℃情況下耐熱穩(wěn)定性提高4.5倍的突變型[16].這些研究表明金屬離子對(duì)酶的影響重要性，在本研究中，對(duì)于野生型Ap在EDTA金屬螯合劑存在的情況下，酶活性下降約15.2%，這表明在EDTA存在下Ca2+被奪走，對(duì)Ap酶結(jié)構(gòu)有影響，導(dǎo)致酶活性下降.突變型T179G、D200G、T179G/D200G不能結(jié)合Ca2+，導(dǎo)致Ap局部空間結(jié)構(gòu)不能穩(wěn)定，致使整個(gè)Ap不能正確的折疊，不能形成正確成熟的Ap結(jié)構(gòu)，不能成功表達(dá).這表明T179、D200是Ap中的Ca2+高親和力結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)Ap的正確折疊和維持成熟穩(wěn)定的活性起到非常重要的作用.

3 結(jié)論

對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性影響的因素較多，如氨基酸殘基的疏水作用、鹽鍵、氫鍵和二硫鍵等，不同結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì)受到具體因素的影響程度具有差異[13].在本試驗(yàn)中，采用理性設(shè)計(jì)在Ap酶中引入二硫鍵的突變型，獲得熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的Y34C-R123C突變型，也獲得穩(wěn)定性相對(duì)減弱的L178C-T252C突變型，以及不能成功表達(dá)的Y34C-R123C/L178C-T252C突變型.結(jié)果表明，在Ap酶中增加二硫鍵以提高其穩(wěn)定性的方法可行，對(duì)于確定增加二硫鍵的具體位點(diǎn)非常關(guān)鍵，應(yīng)盡量選擇酶結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲等構(gòu)象相對(duì)不穩(wěn)定的區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì).

對(duì)Ap酶中預(yù)測(cè)可能參與Ca2+結(jié)合的氨基酸殘基進(jìn)行突變，將含有側(cè)鏈基團(tuán)O的氨基酸殘基突變?yōu)闊o(wú)側(cè)鏈基團(tuán)的G，這導(dǎo)致突變型T179G、D200G、T179G/D200G不能成功表達(dá)，這表明T179和D200殘基對(duì)Ca2+結(jié)合到Ap中至關(guān)重要，同時(shí)Ca2+對(duì)Ap的正確折疊、形成成熟的活性酶具有重要作用.本試驗(yàn)對(duì)Ap類蛋白酶及其他酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究提供了依據(jù).