陳曉菲，高 媛，尤洪蘭，張紅明，于 農(nóng)

（蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州215129）

癌癥是世界范圍的健康問題，也是很多國家人口死亡的主要原因［1］。全球每年都有約140萬例惡性腫瘤病例，死亡人數(shù)達(dá)到70萬人。其中，結(jié)直腸癌（CRC）是位居全球惡性腫瘤的第三位，其死亡率也位居第四位［2］。最近的一項(xiàng)估計(jì)表明，到2030年，預(yù)計(jì)將增加60%的結(jié)直腸癌病例，也就是即將有超過220萬例新病例，死亡人數(shù)也將達(dá)110萬［3］。作為癌癥發(fā)病人數(shù)全球第一的中國，國家癌癥中心于2017年11月發(fā)布了《中國腫瘤的現(xiàn)狀和趨勢(shì)》，報(bào)告中指出，結(jié)腸直癌在我國無論是發(fā)病率還是死亡率都一直穩(wěn)居前五的位置，提高對(duì)于結(jié)直腸癌的認(rèn)識(shí)刻不容緩。對(duì)于結(jié)直腸癌的檢測(cè)、診斷、治療，可以為預(yù)防結(jié)直腸癌惡化提供有效的手段，提高結(jié)直腸癌治愈率及患者生存率［4］。

為完善對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)和預(yù)后，美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)更新了癌癥分期系統(tǒng)，在結(jié)直腸癌的檢測(cè)方法中增加了新的預(yù)后和預(yù)測(cè)因素，以便于基于組織病理學(xué)以及分子生物學(xué)的非侵入性診斷方法的應(yīng)用。推薦的方法中，除了臨床解剖學(xué)特征指標(biāo)，還包括常規(guī)檢測(cè)抗原、相關(guān)蛋白激酶、特征基因改變檢驗(yàn)等多種方法。開發(fā)出更多的腫瘤檢驗(yàn)生物標(biāo)志物，有利于精確地診斷結(jié)直腸癌的階段和預(yù)后，為結(jié)直腸癌治療提供最直觀的建議。

1 常規(guī)結(jié)直腸癌檢驗(yàn)標(biāo)志物

常規(guī)血清癌胚抗原（CEA）、糖蛋白抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9）與某些組織分子相關(guān)的值是常用的結(jié)直腸癌預(yù)測(cè)及預(yù)后檢驗(yàn)診斷的生物標(biāo)志物。其中，癌胚抗原是在結(jié)直腸癌治療和后期進(jìn)行監(jiān)測(cè)的具有公認(rèn)功效的腫瘤標(biāo)志物，也是目前已知指南中推薦用于CRC監(jiān)測(cè)和預(yù)后的唯一血液標(biāo)志物［5］。癌胚抗原是在1965年被發(fā)現(xiàn)的，最初，它被認(rèn)為是具有結(jié)直腸癌特異性的，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)在其他組織如胰腺、胃、支氣管、乳腺等癌癥中也能檢測(cè)到該抗原。從預(yù)后的角度來看，在患者術(shù)前通過檢驗(yàn)手段確定CEA水平，有助于確定患者預(yù)后的預(yù)期壽命［6］。持續(xù)升高的CEA水平就可能指示腫瘤組織存在浸潤或者轉(zhuǎn)移，術(shù)后CEA水平緩慢增加是腫瘤局部復(fù)發(fā)的典型癥狀，而動(dòng)態(tài)升高則說明可能腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移［7］。

最初，CA 19-9是在人類結(jié)直腸癌細(xì)胞系中鑒定出來的黏蛋白樣產(chǎn)物，它是在正常人組織中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原而非腫瘤特異性抗原［8］。其在血清中水平升高是診斷上消化道腺癌和結(jié)直腸癌的重要標(biāo)志物，CA 19-9水平升高是檢驗(yàn)?zāi)[瘤預(yù)后不良的因素。

然而，目前的一系列研究結(jié)果說明在診斷時(shí)僅使用CEA或CA 19-9缺乏靈敏度和特異性［9-10］，尤其CA 19-9對(duì)于腫瘤的的靈敏度遠(yuǎn)低于CEA［11］。因此，需要發(fā)現(xiàn)更多的結(jié)直腸癌檢驗(yàn)診斷的生物標(biāo)志物。目前，F(xiàn)DA也已經(jīng)批準(zhǔn)了CRC早期診斷的甲基化標(biāo)志物進(jìn)行商業(yè)實(shí)驗(yàn)，如SEPT9、NDRG4、BMP3等（商品名EpiproColon?和Cologuard）［12-13］，然而，從預(yù)后或者預(yù)測(cè)的角度來看，臨床上還是沒有出現(xiàn)最適合的標(biāo)志物。

2 新檢驗(yàn)標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)

隨著診斷醫(yī)學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)于信號(hào)通路的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)了眾多腫瘤檢驗(yàn)相關(guān)的標(biāo)志物，隨著這些標(biāo)志物數(shù)量的增長，代表了腫瘤高度多樣化的生物結(jié)構(gòu)以及不同的細(xì)胞階段。在腫瘤發(fā)展過程中，相關(guān)標(biāo)志物的水平可能是動(dòng)態(tài)的，即使是在相同疾病的不同患者體內(nèi)，典型的腫瘤標(biāo)志物也可能各不相同。因此，確認(rèn)在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)不同的腫瘤檢驗(yàn)標(biāo)志物對(duì)于個(gè)體化精準(zhǔn)治療的實(shí)施也具有很重要的意義?；蚬こ痰陌l(fā)展更有利于建立完善的預(yù)測(cè)和預(yù)后體系，為結(jié)直腸癌的治療從群體化向個(gè)體化發(fā)展以及個(gè)性化用藥的實(shí)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。目前對(duì)新的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)集中于蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)及其他相關(guān)方面的研究。

2.1 結(jié)直腸癌相關(guān)蛋白標(biāo)志物

作為目前癌癥治療的一個(gè)重要策略，血管生成相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物的表達(dá)研究在結(jié)直腸癌預(yù)測(cè)預(yù)后指標(biāo)的建立中有很大的潛力［14］。通過對(duì)正常細(xì)胞和惡性結(jié)直腸組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)分析顯示，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)特異性升高的46個(gè)轉(zhuǎn)錄物中，有9種轉(zhuǎn)錄物可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)，命名為腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物（TEM）。TEM在人類腫瘤內(nèi)皮中的表達(dá)量是正常細(xì)胞的20倍，可能有助于區(qū)分腫瘤和正常內(nèi)皮細(xì)胞［15］。其中TEM1可能是由腫瘤細(xì)胞大量繁殖造成高密度及缺氧環(huán)境調(diào)控表達(dá)，其在遠(yuǎn)端正常黏膜和原發(fā)腫瘤間基質(zhì)中表達(dá)顯著增加，說明TEM1可能參與腫瘤侵襲（進(jìn)展和轉(zhuǎn)移）。因此，可以設(shè)計(jì)靶向TEM1的抗體用于腫瘤的治療。TEM5和TEM7也與腫瘤相關(guān)血管系統(tǒng)的過度表達(dá)有關(guān)［16］，TEMs的檢測(cè)也較為簡(jiǎn)便，可以是未來腫瘤檢驗(yàn)的一個(gè)有用標(biāo)志物。

腫瘤向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素就是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在結(jié)直腸癌中，有多個(gè)蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這些蛋白標(biāo)志物可以用于表征體內(nèi)存在侵襲性的原發(fā)腫瘤，可以作為評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后的蛋白標(biāo)志物。其中，受體-酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ROR1）的過度表達(dá)就與某些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［17］。Western blot和免疫組化結(jié)果顯示，ROR1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。同時(shí)，ROR1表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.01）。生存分析顯示，ROR1表達(dá)較高的患者總生存期明顯縮短（P＜0.01）。說明ROR1表達(dá)與惡性屬性相關(guān)，并且可以作為結(jié)腸直腸癌檢測(cè)的新型預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。另一個(gè)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移潛在標(biāo)志物絲氨酸-蘇氨酸激酶31（STK31），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)的表達(dá)水平顯著升高［18］。免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，STK31的表達(dá)高于淋巴結(jié)樣品中的RNA水平和蛋白質(zhì)水平，因此也可能是監(jiān)控和預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物。同樣地，通過免疫組化方法比較腫瘤組織與非腫瘤鄰近組織中醛脫氫酶1A1（ALDH1A1）的表達(dá)，結(jié)果顯示，CRC組織中ALDH1A1蛋白表達(dá)顯著增加。在CRC患者中，ALDH1A1蛋白表達(dá)增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在顯著相關(guān)：N0病例中為64.28%；N1例病例占75.49%；在N2情況下為82.14%，（P＝0.002）。因此，CRC組織中ALDH1A1蛋白的表達(dá)可能是CRC患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物［19］。

質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展給候選蛋白的驗(yàn)證帶來了新的方法。選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）是一種具有高分辨率高精度的靶蛋白組學(xué)方法，三重四極質(zhì)譜儀即可以完成該檢測(cè)。通過這種方法可以驗(yàn)證多個(gè)候選的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物［20］。有研究利用SRM進(jìn)行靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析估算患者血清胞外囊泡成分中的候選蛋白，確定了一些潛在的早期診斷結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志候選物。通過對(duì)SRM驗(yàn)證得到的37個(gè)肽進(jìn)行ROC分析，發(fā)現(xiàn)其中有3個(gè)肽類是高度敏感，AUC在0.7～0.9，而通過SPSS軟件進(jìn)行基于邏輯回歸的候選標(biāo)志物組合分析發(fā)現(xiàn)，將肽類進(jìn)行組合后，得到的靈敏度可以進(jìn)一步提高。特別是有8種肽類組合的AUC均大于0.9，其中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白1、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白、血管生成素-1這三種蛋白組合的AUC可以達(dá)到0.97，說明多種標(biāo)志物結(jié)合可以提高CRC早期診斷的準(zhǔn)確性。而在SRM驗(yàn)證的肽類中，有17種肽類的靈敏度都超過了CEA［21］。

2.2 結(jié)直腸癌相關(guān)核酸標(biāo)志物

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是微衛(wèi)星染色體的編碼和非編碼序列的變化，比如重復(fù)的DNA序列的增殖或丟失，這會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中微衛(wèi)星區(qū)域的縮短或延伸。錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR）可以消除這些突變，因此，MSI可能是由這些基因的突變引起的［22］。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可分為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性低（MSI-L），這取決于與MSI特征相關(guān)基因座的百分比。在CRC II期和III期患者的回顧性研究分析中發(fā)現(xiàn)，無論癌癥的進(jìn)展如何，MSI-H都是改善總體生存的預(yù)測(cè)因素，與MSI-L或缺乏MSI特征的腫瘤細(xì)胞相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較低［23］。MSI可能是預(yù)后的一個(gè)重要檢測(cè)因素。

DNA基因的突變也是腫瘤細(xì)胞大量增殖的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，12號(hào)染色體短臂上第12位密碼子（80%的患者）或13位密碼子的KRAS基因突變可以作為患者接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療的生物標(biāo)志物［24］。在許多實(shí)體瘤中都存在編碼磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的p110α催化亞基的基因突變，包括CRC。PIK3CA基因在10%～20%的CRC腫瘤中發(fā)生突變。與PIK3CA野生型腫瘤患者相比，PIK3CA突變腫瘤患者的結(jié)直腸癌特異性死亡率增加［25］。在患有KRAS野生型腫瘤的患者中，PIK3CA突變的存在與結(jié)直腸癌特異性死亡率的顯著增加相關(guān)。相反，PIK3CA突變對(duì)KRAS突變腫瘤患者的死亡率沒有顯著影響。而對(duì)于伊立替康治療患者來說，其UGT1A1基因多態(tài)性又是潛在毒性的重要生物標(biāo)志物。在使用伊立替康治療前檢測(cè)其UGT1A1基因，可以避免產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。上述結(jié)果說明不同基因位點(diǎn)的突變可能獨(dú)立影響了腫瘤的預(yù)測(cè)或者預(yù)后效果，因此，也有必要對(duì)于腫瘤患者基因組中特定生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，以利于個(gè)體化精準(zhǔn)化治療的順利實(shí)施。

在過去十年中，對(duì)小RNA（miRNA）功能的研究改變了我們對(duì)細(xì)胞和疾病的理解，尤其是在癌癥生物學(xué)方面。因此，越來越多的人開始將它們作為癌癥治療過程中能夠揭示疾病進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物的候選物［26］。基于miRNA的分析是非侵入性的，它們?cè)诎┌Y檢測(cè)過程中具有高度的靈敏度，選擇性和特異性。另外，用于miRNA分析的工具簡(jiǎn)便易用，如實(shí)時(shí)定量PCR［27］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多具有生物標(biāo)志物潛力的miRNA。使用微陣列檢查來自相同CRC患者的血漿外泌體，原發(fā)性腫瘤組織和肝轉(zhuǎn)移組織的miRNA譜。結(jié)果顯示，在三者中，miR-21水平都高度上調(diào)。高外顯子-miR-21患者的總生存率和無病生存率明顯低于低miR-21患者。血漿外泌體miR-21水平檢測(cè)是用于預(yù)測(cè)II期，III期或IV期CRC患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的重要生物標(biāo)志物［28］。WANG等［29］研究了CRC中的miRNA-552水平。他們指出也可以使用miR-552作為生物標(biāo)志物來進(jìn)行CRC預(yù)后不良的預(yù)測(cè)。事實(shí)上，miR-552促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，在晚期的CRC中表達(dá)水平也更高［30］。

也有研究顯示，miR626852在CRC組織中與鄰近的正常組織相比表達(dá)不足，miR626852的過表達(dá)能顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖和侵襲。miR626852的表達(dá)與CRC轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，而與患者預(yù)后呈正相關(guān)。進(jìn)一步的研究顯示，TCF7是CRC細(xì)胞中miR626852的直接靶標(biāo)。過表達(dá)miR626852可顯著抑制CRC細(xì)胞中TCF7的mRNA和蛋白水平［31］。miR626852通過靶向TCF7可以在CRC治療中起抑制腫瘤的作用，這也是CRC臨床檢驗(yàn)的一個(gè)潛在指標(biāo)。

另外，包括CRC在內(nèi)的很多腫瘤中，都存在啟動(dòng)子高度甲基化引起的腫瘤相關(guān)基因的表觀遺傳沉默。在很多CRC患者的血液中都能檢測(cè)到腫瘤特異性的DND甲基化，研究發(fā)現(xiàn)，在CRC患者中，MAL、SEPT9、TAC1、NELL1、CRABP1、SST及EYA4這七個(gè)基因甲基化程度更高［32-33］。這些血清中甲基化的基因?qū)τ贑RC預(yù)后或預(yù)測(cè)具有一定的潛力。血清中另一類標(biāo)志物，長鏈非編碼RNA（lncRNA）也是宿主-腫瘤應(yīng)答的重要介質(zhì)。如Gas5與結(jié)腸癌大小就呈負(fù)相關(guān)［34］，lncRNA UICLM則作為miR-215的一種競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)源RNA，即ceRNA，調(diào)控ZEB2的的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生［35］。而lncRNA h19可以與miR-138和miR-200a競(jìng)爭(zhēng)，拮抗其功能，影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，從而作為預(yù)測(cè)的的標(biāo)志物［36］。以上研究說明lncRNA可能同時(shí)涉及多個(gè)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展過程中的多個(gè)途徑，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，可能有利于更好地對(duì)CRC進(jìn)行預(yù)測(cè)或預(yù)后分析。

2.3 結(jié)直腸癌相關(guān)其他標(biāo)志物

最近的研究表明，基于生物流體的代謝組學(xué)也可以識(shí)別潛在的CRC診斷代謝標(biāo)志物。采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）249例CRC患者的血清代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，CRC患者有明顯的代謝特征，其中，有72個(gè)代謝產(chǎn)物有特征性表達(dá)，涉及了三羧酸（TCA）循環(huán)、尿素循環(huán)、谷氨酰胺、脂肪酸和腸道菌群代謝，均與正常人群不同［37］。在CRC患者中，油酸、鳥氨酸是具有最顯著差異的兩種代謝產(chǎn)物，丙酮酸鹽在CRC患者中的水平也高于健康對(duì)照組，而一些TCA循環(huán)中間產(chǎn)物，如富馬酸和順式烏頭酸，在CRC患者中呈現(xiàn)耗竭狀態(tài)。另外，在CRC組織中氨基酸水平高，而血清中氨基酸缺失，這可能是由于癌細(xì)胞中氨基酸消耗量增加所致。有報(bào)告顯示CRC患者溶血酶水平降低，脂肪酸合成酶表達(dá)增加。也有研究發(fā)現(xiàn)，CRC男性患者糞便脂肪酸代謝組特征的變化，尤其是總ω-6多不飽和脂肪酸中的亞油酸水平，顯著高于健康男性，因此，糞便脂肪酸也可能是CRC檢驗(yàn)工作中的新型篩查工具［38］。這些代謝變化是有標(biāo)志性的，因此，采用一組血清代謝產(chǎn)物標(biāo)志物作為CRC預(yù)測(cè)的方法也具有很大的潛力

除了常規(guī)標(biāo)志物，目前也發(fā)現(xiàn)了很多其他類型的生物標(biāo)志物。比如年齡對(duì)于MSI的影響。在老年人（≥50歲）群體中，高患病率（79%）與MSI中MLH1基因丟失相關(guān)，這種MMR失活模式是由甲基化沉默來驅(qū)動(dòng)的［39］。而在≤30歲的CRC患者中，出現(xiàn)了廣泛的MMR基因丟失與BRAF突變，這與老年人MMR有所不同［23］。另外，也有研究顯示，活化凝血系統(tǒng)的程度與某些惡性腫瘤（包括結(jié)直腸癌）的腫瘤分期和預(yù)后相關(guān)［40］。纖維蛋白降解的終產(chǎn)物D-二聚體在較大腫瘤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管入侵的患者中顯著升高。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，晚期和復(fù)發(fā)性CRC患者中血漿D-二聚體水平高的患者存活率明顯縮短［41］。腫瘤基質(zhì)細(xì)胞對(duì)尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）的結(jié)合激活纖溶酶原，u-PA的生物活性對(duì)局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移起重要作用。這種侵襲性在臨床上反映為升高的纖維蛋白降解產(chǎn)物，即較高的D-二聚體水平與較高的疾病階段。因此，在凝血和纖維蛋白溶解系統(tǒng)中的腫瘤相關(guān)降解產(chǎn)物的檢測(cè)可用作腫瘤負(fù)荷和結(jié)果的預(yù)測(cè)因子。

個(gè)體化精準(zhǔn)治療的發(fā)展，給CRC治療過程中用藥的選擇性也帶來了新的挑戰(zhàn)，如部分CRC患者表現(xiàn)出5-Fu抵抗，有相關(guān)研究顯示，lncRNA h19可以作為ceRNA，作用于miR-194-5p，影響其與靶點(diǎn)SIRT1的結(jié)合，從而觸發(fā)自噬，形成化學(xué)抵抗，影響5-Fu化療效果［42］。MSI與MMR也是影響氟尿嘧啶類藥物療效的原因。而對(duì)于腫瘤治療的另一利器，抗體藥物來說，其作用靶點(diǎn)的狀態(tài)，更是CRC預(yù)后檢測(cè)的重要因素。在中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015版）中，就推薦確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的患者檢測(cè)KRAS、NRAS、BRAF基因狀態(tài)，這些基因突變的患者，都有可能對(duì)單抗藥物治療無效。隨著各種凝膠電泳、水凝膠以及納米材料傳感器等檢測(cè)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，也有各種不同的新型技術(shù)應(yīng)用于新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)活動(dòng)中。

3 展望

目前對(duì)于CRC新的生物標(biāo)志物的研究還在不斷進(jìn)行，無論是蛋白質(zhì)組學(xué)還是基因組學(xué)都將涌現(xiàn)越來越多的生物標(biāo)志物。將它們組合應(yīng)用于CRC的檢驗(yàn)工作和預(yù)后評(píng)估，并針對(duì)不同生物標(biāo)志物的水平進(jìn)行靶向治療，未來有可能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化、個(gè)體化的CRC治療以及CRC死亡率的改善。