肖珊珊，黃明珠，張 旭，侯 陽，于 兵

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，遼寧 沈陽 110004）

原發(fā)性夜間遺尿癥（Primary nocturnal enuresis，PNE）在5歲以上的兒童中發(fā)病率高達(dá)15%[1]，給患兒帶來長期持續(xù)性的心理創(chuàng)傷，嚴(yán)重影響患兒的身心發(fā)育和生活質(zhì)量。近年來，針對(duì)PNE的家系研究表明，遺傳因素在PNE的發(fā)病中起著重要作用[2]。我們的研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體D4基因（Dopamine receptor D4，DRD4）啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-616C/G（rs747302）單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）可能與PNE的發(fā)病有相關(guān)性[3]，但是rs747302基因型與PNE患兒腦氧攝取的相關(guān)性研究，截至目前未見報(bào)道。本研究擬應(yīng)用T2弛豫自旋標(biāo)記（T2-relaxation-under-spin-tagging，TRUST）技術(shù)[4]，結(jié)合DRD4-616C/G基因型檢測，探索rs74-7302基因型對(duì)PNE患兒腦氧攝取率（Oxygen extraction fraction，OEF）以及腦氧代謝率（Cerebral metabolic rate of oxygen，CMRO2）[5]的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取2016年2月—2017年12月我院就診的60例PNE患兒，及60例在年齡、性別、受教育程度方面與PNE患兒組匹配的對(duì)照組正常兒童。本研究計(jì)劃獲得我院倫理委員會(huì)許可（批準(zhǔn)號(hào)2013PS24K）并在其監(jiān)督下進(jìn)行，所有參加研究兒童的家屬或者其法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后參與研究。

入組PNE患兒遺尿癥狀符合國際兒童排尿節(jié)制學(xué)會(huì)（ICCS）診斷標(biāo)準(zhǔn)：每周夜尿≥3次，持續(xù)6月以上，日間能夠控制排尿，而入睡后無法自主控制排尿，排除泌尿系統(tǒng)器質(zhì)性疾病[6]。所有參加研究兒童智商（IQ）＞85；無神經(jīng)及精神疾病病史；無睡眠呼吸異常病史；無服用任何典型或非典型精神活性藥物史。

1.2 數(shù)據(jù)采集

1.2.1 DRD4-616C/G基因型分析

全體受試兒童采集外周靜脈血5 mL，采用EDTA抗凝，提取基因組DNA操作使用Biomiga公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒（EZgene TM Blood gDNA Miniprep Kit，Biomiga Inc.，San Diego，CA，USA）。使用ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀（Perkin-Elmer，Norwalk，CT，USA），采用等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)檢測DRD4基因上游5’端啟動(dòng)子區(qū)-616 C/G多態(tài)性，基因擴(kuò)增引物分別采用F：GAACCTACCCCGGCCTGTCGT、R：AGACGGGAATGAAGCGAGGTGG、C specific：TGGTCGCGGGGGCTGAGC、G specific：CCCCCCMGCAGCCTCTGGYC及其退火溫度均為69℃。PCR擴(kuò)增C特異性產(chǎn)物片段長度415 bp，G特異性產(chǎn)物片段長度267bp，共有產(chǎn)物片段長度645bp。因?yàn)槿巳褐蠧C基因型的頻率很低，因而將CC和CG基因型受試兒童合并為C等位基因攜帶組（C組），將G純合子（GG）受試兒童定為G組進(jìn)行深入統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 磁共振掃描數(shù)據(jù)處理

受試兒童脈搏血氧儀測定動(dòng)脈血氧飽和度（SPO2）后，立即應(yīng)用Philips Ingenia 3.0T超導(dǎo)型磁共振掃描系統(tǒng)及16通道SENSE頭線圈進(jìn)行MRI掃描。應(yīng)用TRUST序列測算被試兒童的靜息態(tài)OEF，參數(shù)如下：TR 1 978 ms，eTE 1，40，80，160 ms，F(xiàn)OV：220mm，矩陣：64×64，層數(shù)：1層，軸向?qū)雍瘢?mm，掃描層面位于竇匯上方20 mm，平行于前后聯(lián)合連線（AC-PC），掃描時(shí)間72 s。

采用霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院放射科陸漢璋教授團(tuán)隊(duì)撰寫，基于Matlab平臺(tái)運(yùn)行的軟件包，對(duì)TRUST圖像進(jìn)行后處理，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校正，然后對(duì)標(biāo)記圖像和未標(biāo)記圖像進(jìn)行配對(duì)相減以獲得上矢狀竇內(nèi)的血液信號(hào)。之后對(duì)不同eTE的上矢狀竇內(nèi)的血液信號(hào)進(jìn)行指數(shù)擬合，換算出T2，R2（1/T2）以及R2的95%可信區(qū)間（圖1）。如果受試者R2的95%可信區(qū)間＞10（說明原始數(shù)據(jù)受嚴(yán)重干擾，通常是頭動(dòng)所致，所以R2計(jì)算結(jié)果不可信），則排除該患者的數(shù)據(jù)。之后，根據(jù)陸漢璋教授的血氧含量與T2的換算方法，得出靜脈血氧含量Yν[7]。根據(jù)公式OEF=（SPO2-Yν）/SPO2計(jì)算所有被試兒童的OEF。

相差法掃描來測算腦平均血流量（CBF）。具體步驟如下：首先通過3D時(shí)間飛躍法（TOF）頸部MRA掃描定位雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈；之后分別垂直上述4支血管進(jìn)行相位對(duì)比法（PC）掃描，掃描層數(shù)為1層，像素大小=0.5 mm×0.5 mm×5 mm；FOV=200 mm×200 mm×5 mm；最大流速=40 cm/s；每支血管掃描時(shí)間15.2 s。

應(yīng)用陸漢璋教授編寫的PC法掃描圖像后處理程序，對(duì)相位圖進(jìn)行后處理，手工劃定所掃描的頸部血管作為感興趣區(qū)，計(jì)算頸部血管的血流速度及血管截面積，根據(jù)4支頸部血管的血流速度及血管截面積，計(jì)算全腦總血流量。應(yīng)用VBM8軟件包，根據(jù)3D T1WI圖像，計(jì)算腦實(shí)質(zhì)體積（灰質(zhì)及白質(zhì)）；根據(jù)Herscovitch的研究結(jié)果，設(shè)定腦實(shí)質(zhì)平均密度1.06。最后根據(jù)全腦總血流量，腦實(shí)質(zhì)體積及腦實(shí)質(zhì)密度，計(jì)算CBF（圖1）。

得出CBFmean和Yν之后，根據(jù)菲克原理（Fick principle）計(jì) 算CMRO2：CMRO2=CBF×（Yα-Yν）×Hct。Hct：紅細(xì)胞比容。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以分組（PNE/正常對(duì)照）和基因型（C/G）作為可能的影響因素，將年齡、接受教育時(shí)間和IQ作為協(xié)變量，對(duì)CBF，Yν及OEF數(shù)據(jù)進(jìn)行協(xié)方差分析，計(jì)算分組及基因型這兩個(gè)影響因素的主效應(yīng)及交互效應(yīng)。如果交互效應(yīng)顯著，則進(jìn)一步進(jìn)行Post-Hoc檢驗(yàn)，檢驗(yàn)PNE和對(duì)照組各自組內(nèi)不同基因型被試兒童SPO2，Yν或OEF的差異，采用Bonferroni法對(duì)Post-Hoc檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較校正，以校正后P＜0.05作為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

4例PNE患兒以及2例正常對(duì)照組兒童R2的95%可信區(qū)間＞10，他們的基因型數(shù)據(jù)和影像數(shù)據(jù)均不被統(tǒng)計(jì)。列入統(tǒng)計(jì)的被試基因檢測結(jié)果見表1，他們的基本情況（年齡、接受教育時(shí)間和IQ）見表2。

協(xié)方差分析發(fā)現(xiàn)Yν、OEF以及CMRO2分組×基因型交互效應(yīng)顯著（F1，110=6.513，P=0.012 1；F1，110=6.888，P＜0.001；F1，110=13.01，P＜0.001），Post-Hoc檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)果攜帶C等位基因的PNE患兒OEF以及CMRO2值顯著低于G純合子PNE患兒（t=-5.976，Padjusted＜0.001；t=-5.594，Padjusted＜0.001）；Yν顯著高于G純合子PNE患兒（t=5.863，Padjusted＜0.001），而不同基因型的正常對(duì)照組兒童之間無顯著差異（圖2，表3）。

表1 所有被試DRD4-616位點(diǎn)基因檢測結(jié)果

表2 所有被試基本情況

3 討論

表3 所有被試腦氧代謝情況

近幾年發(fā)展起來的TRUST是一種有用的技術(shù)，通過測量靜脈血中T2獲得上矢狀竇中靜脈血氧含量的定量值，它對(duì)血氧的變化很敏感，并應(yīng)用于各種生理及病理?xiàng)l件下。靜脈氧含量與動(dòng)脈氧含量和腦血流結(jié)合時(shí)可以估計(jì)重要的生理參數(shù)，例如氧攝取分?jǐn)?shù)和氧的腦代謝率，反映組織活力和功能。TRUST技術(shù)測量Yν結(jié)果的可重復(fù)性已經(jīng)被多中心大樣本研究所驗(yàn)證[8]。

圖1 TRUST掃描與圖像后處理。圖1a：TRUST的掃描定位。圖1b：TRUST數(shù)據(jù)后處理以后得到的上矢狀竇血液信號(hào)。圖1c：不同eTE的上矢狀竇內(nèi)的血液信號(hào)進(jìn)行指數(shù)擬合。圖1d：采用相位對(duì)比法（PC）進(jìn)行雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈掃描。Figure 1.TRUST MRI scan and image post-processing.Figure 1a：The imaging slice of the TRUST MRI scan.Figure 1b：The blood signal in the superior sagittal sinus after the TRUST data post-processing.Figure 1c：Monoexponential fitting of blood signal in the superior sagittal sinus as a function of effective echo time(eTE)results in T2estimation.Figure 1d：Bilateral internal carotid artery and vertebral artery scan by phase-contrast MRI method.

圖2 DRD4-616-C/G SNP對(duì)PNE患兒腦氧代謝的影響。圖2a：DRD4-616-C/G SNP對(duì)PNE患兒Yν的影響。圖2b：DRD4-616-C/G SNP對(duì)PNE患兒OEF的影響。圖2c：DRD4-616-C/G SNP對(duì)PNE患兒CBF的影響。圖2d：DRD4-616-C/G SNP對(duì)PNE患兒CMRO2的影響。Figure 2.The effect of DRD4-616-C/G SNP on brain oxygen metabolism in children with PNE.Figure 2a：The effect of DRD4-616-C/G SNP on Yνin children with PNE.Figure 2b：The effect of DRD4-616-C/G SNP on OEF in children with PNE.Figure 2c：The effect of DRD4-616-C/G SNP on CBF in children with PNE.Figure 2d：The effect of DRD4-616-C/G SNP on CMRO2in children with PNE.

我們的研究發(fā)現(xiàn)DRD4-616C等位基因攜帶的PNE患兒OEF和CMRO2都顯著升高，提示這些兒童氧耗量升高，而且相對(duì)缺氧。我們推測：DRD4啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性影響了DRD4蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響DRD4蛋白的數(shù)量與功能[9]，進(jìn)而影響PNE患兒腦發(fā)育過程中對(duì)無效及低效突觸連接的修剪[10-11]，這些冗余突觸致使C等位基因攜帶的PNE患兒腦氧耗量偏高及相對(duì)缺氧。而缺氧導(dǎo)致了PNE患兒在睡眠期間喚醒閾升高[12]。致使PNE患兒在睡眠期間對(duì)膀胱充盈的信號(hào)不能產(chǎn)生有效的覺醒反應(yīng)，從而導(dǎo)致遺尿。

我們的研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)DRD4-616C/G SNP僅僅影響了PNE患兒腦氧代謝。對(duì)正常對(duì)照組兒童沒有影響，這可能是由于突觸修剪受多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)受體影響，雖然正常兒童中C等位基因攜帶者也存在DRD4蛋白的異常，但可能被別的神經(jīng)遞質(zhì)所代償；而PNE患兒中的C等位基因攜帶者卻缺乏相應(yīng)代償機(jī)制，所以表現(xiàn)出了腦氧耗量以及缺氧。

我們的研究還存在較多局限性，首先，由于樣本數(shù)目有限，而且C等位基因純合子的頻率很低，因而我們?cè)谘芯恐袑C和CG合并為一組，這樣合并可能造成一定程度的遺傳效應(yīng)混淆。其次，我們的腦氧代謝數(shù)據(jù)是在患兒靜息狀態(tài)下采集的，靜息狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的CBF異常，是否在睡眠狀態(tài)下依然存在，還需要應(yīng)用同步EEG-PET或者EEG-MRI采集技術(shù)，深入進(jìn)行睡眠狀態(tài)下的影像研究。再次，本研究測得的PNE患兒腦氧代謝參數(shù)只是全腦范圍的平均值，而無法精確地對(duì)不同腦區(qū)的腦氧代謝狀況進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估。為了深入研究PNE患兒的腦氧代謝異常，我們還需要結(jié)合睡眠監(jiān)測及隨訪，進(jìn)行深入、大樣本的隊(duì)列研究。