胡平華 黃 勤 李志華 歐陽倩雯

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，在全世界女性惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率居首位[1～3]。乳腺癌的治療除了考慮腫瘤的組織學(xué)分類、大小、臨床分期等臨床病理參數(shù)外，眾多的分子標(biāo)志物如雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)，人類表皮生長(zhǎng)因子受體2亞型(HER-2)和Ki-67在乳腺癌臨床治療、預(yù)后及化療過程中起著重要作用[4～6]。目前學(xué)者根據(jù)ER、PR、HER-2的表達(dá)情況將乳腺癌分為L(zhǎng)umial A型(即腔面A型)、Lumial B型(腔面B型)、HER-2陽性型、三陰性型[7,8]。但這四種分型的乳腺癌患者治療、化療及預(yù)后情況都不盡相同，所以乳腺癌的治療已逐漸采取精準(zhǔn)的個(gè)體治療[4～6]。本研究前期已經(jīng)采用免疫熒光技術(shù)獲得這四種分型乳腺癌細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)這四種乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力進(jìn)行分析，以期能指導(dǎo)臨床用藥。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM/F-12(1:1)、B-27、膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅳ購于GIBICO公司，批號(hào)分別為1861453，1933114，17100-017，17104-019。Human bFGF購于Bioss公司，批號(hào)：AD04041527。Human EGF購于Cyagen公司，批號(hào)：L10504123。Human Insulin購于MCE公司，批號(hào)：29386。胰蛋白酶-EDTA消化液、鏈霉素混合液(100X)購于Solarbio公司，批號(hào)分別為：T1300，P1400。cck8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購于凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：KGA317。70微米細(xì)胞篩購于NEST。BPN-80CW CO2培養(yǎng)箱購于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。DHP-9054熱恒溫培養(yǎng)箱、BYC-310藥品冷藏柜均購于山東博科生物。DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱購于恒科學(xué)儀器有限公司。CX41顯微鏡購于OLYMPUS。UV-1600PC紫外分光光度計(jì)購于上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 原代細(xì)胞分離及培養(yǎng) 腔面A型、腔面B型、HER-2陽性型、三陰性型(TNBC)乳腺癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化分離獲得。將分類好的4種分型的人乳腺癌樣本在超凈工作臺(tái)中分別放入含有雙抗(10X)的D-PBS液中浸泡清洗10min。將標(biāo)本放入培養(yǎng)皿中，以D-PBS液沖洗，用無菌的手術(shù)器械剔除多余部分，保留腫瘤組織塊備用。將修剪好的乳腺癌標(biāo)本放在另一培養(yǎng)皿中，浸泡剪碎，過70微米細(xì)胞篩收集浸泡液。加入消化液震蕩消化，收集濾液并保存。濾液離心去上清，重懸后鋪板培養(yǎng)。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 在鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好且細(xì)胞的融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化2min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打下來并吸取到10ml離心管中，離心，棄上清，加入培養(yǎng)液重懸沉淀，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml。向96孔培養(yǎng)板中加入100μL重懸的細(xì)胞，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。向每孔中加入10μL的CCK-8溶液(氣泡會(huì)影響OD值的讀數(shù)，設(shè)法除去孔中生成的氣泡)。將96孔培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好后準(zhǔn)備劃痕遷移。在12孔板底部用直尺劃兩條平行的直線。胰酶消化后離心細(xì)胞棄去上清。用培養(yǎng)基將沉淀重懸后鋪于該孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達(dá)到100%的密度后，用槍頭在每個(gè)孔進(jìn)行劃痕。棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗，加入不含血清的培養(yǎng)基。選取劃痕較直的位置拍照，每個(gè)孔定點(diǎn)拍0h的照片。將劃痕的培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后再次給每個(gè)孔的劃痕拍照，拍照位置要和0h的位置(定點(diǎn))重合，即兩次時(shí)間點(diǎn)所拍的為同一個(gè)位置的劃痕。使用24h劃痕數(shù)據(jù)與0h劃痕數(shù)據(jù)求出對(duì)應(yīng)的劃痕寬度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的遷移速率。計(jì)算公式：遷移速率=遷移距離(μm)/遷移時(shí)間(h)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果 如圖1所示，分別為4種分型的人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)24h后的檢測(cè)結(jié)果。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與HER-2型比較，三陰性型乳腺癌細(xì)胞活力最高，腔面A型和B型活力較低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 細(xì)胞活力的測(cè)定注：與HER-2陽性型相比，**P<0.01。

圖2-1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

圖2-2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力注：與HER-2陽性型相比，**P<0.01。

2.2 細(xì)胞遷移能力的測(cè)定 采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4種乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖2所示：除腔面B型乳腺癌細(xì)胞遷移失敗，與HER-2陽性型比較，腔面A型和B型遷移速率均較弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。三者比較：HER-2陽性型遷移速率最快，腔面A型次之，三陰性型最弱。

3.討論

自從Perou等學(xué)者通過研究乳腺癌表型的多樣性提出了乳腺癌的分子分型以來，有眾多研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌不同的分子分型對(duì)患者的預(yù)后及化療具有不同的影響[9～11]。目前學(xué)者已將乳腺癌分為L(zhǎng)umial A型(即腔面A型：ER/PR+，Her-2且Ki-67<14%)、Lumial B型(腔面B型：ER/PR+，Her-2或Ki-67>14%)、HER-2陽性型(ER-，PR-，HER-2+)、三陰性型(ER-，PR-，HER-2-)[7,8]。研究認(rèn)為腔面A型乳腺癌患者僅需要進(jìn)行內(nèi)分泌治療，而其他三種分子分型還需要進(jìn)行化療[12]。對(duì)于HER-2過表達(dá)的患者手術(shù)前需確認(rèn)HER-2狀態(tài)，并輔助靶向藥物進(jìn)行治療[13]。而三陰性乳腺癌患者預(yù)后最差，腫瘤惡性程度高，除了早期診斷外還需要結(jié)合化療治療[14]。因此經(jīng)過多年的探索，通過分子分型進(jìn)行精準(zhǔn)的個(gè)體化治療取得了較好的治療效果。

本研究前期通過原代組織培養(yǎng)及免疫熒光技術(shù)分離并鑒定獲得了腔面A型、腔面B型、HER-2陽性型及三陰性型乳腺癌細(xì)胞。本次研究通過CCK-8法及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四種不同分析乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移能力，其中CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三陰性型、HER-2陽性型、腔面A型及腔面B型細(xì)胞活力依次降低，而劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HER-2陽性型遷移速率最快，腔面A型次之，三陰性型最弱。從而說明HER-2陽性患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高，HER-2過表達(dá)的乳腺癌患者對(duì)三苯氧胺等化療藥物耐藥，而且腫瘤惡性程度高，進(jìn)展速度，轉(zhuǎn)移快，致使化療效果差[15]；HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞增殖活力較高，繼而使其細(xì)胞遷移速率較快，腫瘤惡性生物學(xué)行為高，最終導(dǎo)致治療化療效果差。

綜上所述，三陰性型、HER-2陽性型、腔面A型及腔面B型細(xì)胞活力依次降低，且HER-2陽性型乳腺癌細(xì)胞遷移速率最快。