周 婧

近年來，隨著人口老齡化和環(huán)境污染加劇，肺癌的發(fā)病率及致死率逐年增高，已成為癌癥引起死亡的主要病種之一[1,2]。在我國，肺癌的發(fā)病率和病死率高居所有惡性腫瘤之首，且呈逐年增高的趨勢，對人類健康構成嚴重威脅[3,4]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)發(fā)病率肺癌總發(fā)病率的80%～85%，患者生存率較低，5年生存率僅約為15%[5,6]。目前，針對肺癌的治療方法越來越多，如手術，化療、放療及生物靶向治療等，但是不能有效提高肺癌患者生存率。據(jù)報道，復發(fā)或轉移仍是導致患者預后差、死亡率高的主要原因[7～9]。因此，開發(fā)和尋找有效控制肺癌復發(fā)或轉移的藥物對治療非小細胞肺癌具有重要意義。

由于非小細胞肺癌患者復發(fā)率高、轉移率高[10]，因此長期服用中藥已成為肺癌輔助治療的重要手段[11～13]。據(jù)報道，清熱解毒方已應用于中醫(yī)治療肺癌、人乳頭瘤、子宮內膜癌、鼻咽癌、胃癌等癌癥，但并未有研究表明清熱解毒方對非小細胞肺癌的影響。本研究探討清熱解毒方對非小細胞肺癌細胞生物學的影響，為臨床治療肺癌提供新思路。

1.材料與方法

1.1 清熱解毒方藥物組分 銀花、連翹、黃連、黃芩購于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院門診部。銀花12g，連翹15g，黃連6g，黃芩8g。采取常法煎煮藥物，在60℃恒溫條件下，將藥物濃縮成生藥1g/ml的濃縮液，采用壓力高溫滅菌后，將藥物濃縮液保存于-4℃冰箱(Thermo，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)和給藥處理 肺癌細胞株A549細胞購于ATCC細胞庫，應用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone，美國)培養(yǎng)細胞，并將細胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱(Thermo，美國)中進行常規(guī)培養(yǎng)。待細胞匯合度達到90%以上，應用0.25%胰酶(碧云天，中國)消化細胞，將細胞傳至下一代。將細胞分為對照組和清熱解毒方不同劑量給藥組，給藥組分別給予50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml清熱解毒方濃縮液后進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT實驗 將肺癌細胞株A549細胞接種于96孔板中，待細胞生長至對數(shù)生長期時，給予清熱解毒方濃縮液，24h后每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)孵育細胞，4h后棄凈溶液，加入150μl體積的DMSO溶液，震蕩混勻。并將細胞置于酶標儀(Biotek，中國)中，在490nm波長處檢測細胞吸光度(OD)值。

1.4 臺盼藍染色實驗 將肺癌細胞株A549細胞接種于六孔板中，待細胞匯合度達到約80%時，給予清熱解毒方濃縮液，24h后收集細胞。向細胞加入0.4%臺盼藍染色液(Biosharp，中國)進行染色。3min內，在倒置光學顯微鏡(Olympus，日本)下觀察細胞顏色，并計數(shù)。死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染?；罴毎?%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。

1.5 劃痕實驗 將肺癌細胞株A549細胞接種于六孔板中，待細胞匯合度達到約80%時，給予清熱解毒方濃縮液，并使用經過高壓滅菌的200μl吸頭(BioClean，中國)在細胞培養(yǎng)板底部進行劃痕，并在0h、24h和48h時將細胞置于倒置光學顯微鏡下，拍照，并觀察細胞遷移情況。

1.6 Transwell實驗 將肺癌細胞株A549細胞接種于Transwell小室(Corning，美國)上室，上室中已包被基質膠，并加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。將小室置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱(Thermo，美國)中進行常規(guī)培養(yǎng)。24h后，取出下室細胞，用4%多聚甲醛(索萊寶，中國)固定30min，PBS清洗細胞后，應用濃度為20g/L的結晶紫染色液(Biosharp，中國)孵育20min，并將細胞置于顯微鏡下，拍照并計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 清熱解毒方降低肺癌細胞活性 采用MTT實驗檢測對照組和清熱解毒方不同劑量給藥(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)組肺癌細胞活性。結果顯示，與對照組相比，清熱解毒方不同劑量給藥組肺癌細胞活性顯著降低，且肺癌細胞活性隨著清熱解毒方劑量增加而逐漸降低，100μl/ml和200μl/ml時最為顯著(圖1)。

圖1 清熱解毒方對肺癌細胞活性的影響

2.2 清熱解毒方降低肺癌細胞活細胞率 采用臺盼藍染色實驗檢測對照組和清熱解毒方不同劑量給藥(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)組肺癌細胞活細胞率。臺盼藍染色結果表明，與對照組相比，清熱解毒方不同劑量給藥組肺癌細胞活細胞率顯著降低，隨著清熱解毒方劑量增加，肺癌細胞活細胞率顯著降低，呈劑量依賴性。其中，100μl/ml和200μl/ml清熱解毒方效果最為顯著(圖2)。

圖2 清熱解毒方對肺癌細胞活細胞率的影響

2.3 清熱解毒方抑制肺癌細胞遷移能力 采用劃痕實驗檢測對照組和清熱解毒方不同劑量給藥(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)組肺癌細胞遷移。結果顯示，與對照組相比，清熱解毒方不同劑量給藥組肺癌細胞遷移能力顯著降低，且肺癌細胞遷移能力隨著清熱解毒方劑量增加而逐漸降低，100μl/ml和200μl/ml時降低最為顯著(圖3)。

2.4 清熱解毒方抑制肺癌細胞侵襲能力 采用Transwell實驗檢測對照組和清熱解毒方不同劑量給藥(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)組肺癌細胞侵襲能力。Transwell實驗結果表明，清熱解毒方不同劑量給藥組肺癌細胞侵襲能力顯著低于對照組，且100μl/ml和200μl/ml清熱解毒方組侵襲能力最低(圖4)。

3.討論

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是全世界癌癥致死的主要病種，每年約有100萬人死于肺癌[14]。根據(jù)肺癌病理特征，主要肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)兩種組織學亞型，非小細胞肺癌發(fā)病率占80%左右[15]。非小細胞肺癌具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、病死率高、預后差的特點，嚴重威脅患者的生命和健康。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是個復雜多變的過程，向其他部位轉移是腫瘤致死率高的主要原因[16]。因此，本研究欲尋找能夠抑制肺癌細胞遷移和侵襲的藥物，為臨床治療肺癌提供理論基礎和依據(jù)。

圖3 清熱解毒方對肺癌細胞遷移能力的作用

圖4 清熱解毒方對肺癌細胞侵襲能力的作用

中醫(yī)常采用扶正固本法、清熱解毒法、活血化瘀法、軟堅散結法、祛濕化痰法、以毒攻毒法等方法治療腫瘤，其中清熱解毒法最為常用。中醫(yī)認為，癌瘤之所成，郁結體內的“癌毒”是其重要原因。采用清熱解毒法治療腫瘤，不但能夠抑制腫瘤的發(fā)展，而且能夠雙向調節(jié)機體免疫功能，從而達到解毒抗癌的目的。目前，清熱解毒方廣泛用于多種癌癥患者的輔助治療中，但并未有報道表明清熱解毒方是否對肺癌及肺癌細胞有調控功能。因此，本研究探討清熱解毒方對肺癌細胞活力、存活率、遷移和侵襲能力的作用，進而研究其對肺癌發(fā)生發(fā)展中的影響。MTT實驗和臺盼藍染色實驗結果表明，不同劑量清熱解毒方能夠降低肺癌細胞株A549細胞活力和活細胞率；劃痕實驗和Transwell實驗結果揭示，不同劑量清熱解毒方能夠降低肺癌細胞株A549遷移能力和侵襲能力，100μl/ml和200μl/ml清熱解毒方效果尤為顯著。

綜上所述，我們認為清熱解毒方可能通過抑制肺癌細胞活力、遷移和侵襲能力，進而抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展，但具體機制有待繼續(xù)研究。治療腫瘤是一條艱苦又漫長的道路，必須重視其發(fā)病原因，針對病因，采用對癥的藥物和方法，才可有效治療腫瘤。