何永丹

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，糖尿病(diabetes mellitus，DM)作為一種常見的慢性代謝性疾病，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈逐年升高的趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國糖尿病的發(fā)病較高，約達到9240萬人口[2]。近年來，隨著人們對心肌胰島素抵抗的逐步認識，研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)生和進展過程中起到至關(guān)重要的作用[3,4]。miRNA是一類存在于真核生物體內(nèi)、長度約為22～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，其可以通過與靶基因配對引起靶基因降解或抑制其翻譯，從而對靶基因的表達進行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[5]。據(jù)報道，miRNA能夠參與生命過程中一系列的生物學過程，但miRNAs在心肌胰島素抵抗中是否發(fā)揮一定的作用及其潛在的機制有待繼續(xù)研究[6]。因此，本研究探討miR-149-3p對糖尿病大鼠心肌細胞胰島素抵抗的干預作用及其具體機制，并為疾病的治療提供新的治療思路及靶點。

1.材料與方法

1.1 大鼠糖尿病模型的建立與鑒定 24只SD雄性大鼠購于上海維通利華公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將SD大鼠隨機分為對照(CTL)組和糖尿病模型(DM)組。對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。糖尿病模型組給予45%脂肪熱量的高脂飼料(Research Diet公司，美國)喂養(yǎng)，12周后，按照30mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(sigma公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)和傳代 大鼠心肌細胞H9c2細胞購于中國科佰生物公司，并采用含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)進行細胞培養(yǎng)，將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)中。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將細胞接種于培養(yǎng)板(Nest公司，中國)中，待細胞匯合度達到60%時，應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine? RNAiMAX Reagent(Thermo公司，美國)，進行細胞轉(zhuǎn)染。分組分別為miR-149-3p mimic、miR-149-3p inhibitor以及隨機對照序列(NC-mimic和inhibitor-NC)，轉(zhuǎn)染48h后進行后續(xù)實驗。

1.4 RNA提取和real-time qPCR實驗 按照Trizol試劑(Thermo，美國)使用說明書提取總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI，美國)和SYBR試劑(羅氏，德國)說明書，并將1μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，并用于real-time qPCR實驗。以U6作為內(nèi)參基因，應(yīng)用2-ΔΔCT方法檢測miR-149-3p的表達情況，且以GAPDH為內(nèi)參，檢測FTO的表達情況。

1.5 高脂培養(yǎng)基的配制 稱取牛胰島素與棕櫚酸鈉(sodium palmitate，PA)(Sigma公司，美國)0.0137g，溶于1ml甲醇中，即配制成濃度為50mM的母液。稱取脫脂BSA 1g，溶于10ml細胞培養(yǎng)專用PBS(Hyclone，美國)中，即配制成10% BSA母液。向DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)加入10% BSA母液，配制成含有1% BSA的培養(yǎng)基，然后加入適量50mM的PA母液，55℃水浴中振蕩使之完全溶解。

1.6 2-脫氧熒光葡萄糖類似物(2-NBDG)吸收的測定 應(yīng)用2-NBDG試劑盒(Invitrogen，美國)檢測細胞葡萄糖攝取情況。首先，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板(Nest，中國)中，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基饑餓6h，每孔加入200μL體積的、含有1μM2-NBDG、含或不含0.1μM胰島素的無血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h，置于熒光酶標儀(Tecan，瑞士)上，檢測細胞內(nèi)熒光強度，用以評估心肌細胞攝2-NBDG的情況。每孔加入CCK-8試劑(同仁，日本)10μL孵育細胞，4h后在波長為490nm處檢測吸光度值。

1.7 western blot實驗 應(yīng)用裂解液(碧云天，中國)裂解細胞15min，并用細胞刮刀刮凈細胞，并以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。取30μg樣品加至SDS-PAGE凝膠電泳槽中進行電泳，并轉(zhuǎn)膜。在4℃條件下，孵育FTO抗體(Abcam，美國)或β-actin抗體(Abcam，美國)過夜。次日，用PBST洗3遍，并在室溫條件下孵育相應(yīng)的二抗(Abcam，美國)1h。最終，經(jīng)化學發(fā)光凝膠成像儀分析蛋白表達情況。

1.8 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 5(GraphPad，美國)分析，所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標準差表示，兩組間差異選用配對t檢驗進行分析，P<0.05時認為差異有顯著性意義。

2.結(jié)果

2.1 miR-149-3p在糖尿病大鼠心肌組織中的表達 稱量兩組大鼠體重，結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠體重顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0004，圖1A)。糖尿病模型組大鼠腹腔注射糖耐量實驗中2h血糖顯著高于對照組(圖1B)。此外，糖尿病模型組大鼠血漿TC、TG和FFA水平均顯著高于對照組(圖1C～1E)。real-time qPCR實驗結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠心肌中miR-149-3p的表達顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0171，圖1F)。

圖1 miR-149-3p在糖尿病大鼠心肌組織中顯著升高

2.2 高糖高脂引起H9c2心肌細胞低表達miR-149-3p及糖攝取減少 在高糖高脂的培養(yǎng)環(huán)境下，細胞分組為對照組(CTL，含糖量為5.6mM)高滲對照組(HO，5.6mM葡萄糖+20mM甘露醇)、高糖培養(yǎng)組(HG，25mM葡萄糖)、高滲高脂培養(yǎng)組(HOHF，5.6mM葡萄糖+20mM甘露醇，300μMPA)以及高糖高脂培養(yǎng)組(HGHF，25mM葡萄糖，300μMPA)，給予24h處理。應(yīng)用real-time qPCR實驗檢測細胞中miR-149-3p的表達情況，結(jié)果顯示，與HO組相比，HG組細胞內(nèi)miR-149-3p的表達水平無明顯改變(圖2A)。HOHF組與HGHF組中miR-149-3p的表達顯著降低，其中HGHF組下降最為顯著。

此外，在HG培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用不同濃度PA進行干預，結(jié)果顯示miR-149-3p的表達隨PA濃度升高而降低(圖2B)。在后續(xù)實驗中采用25mM葡萄糖+500μM PA的培養(yǎng)條件作為高糖高脂組(HGHF)條件，對照組(CTL)采用5.6mM葡萄糖+20mM甘露醇處理。另外，2-NBDG實驗檢測結(jié)果表明，細胞胰島素敏感性隨培養(yǎng)基中PA濃度升高而下降(圖2C)。

圖2 高糖高脂條件下H9c2心肌細胞中miR-149-3p的表達和糖攝取情況

2.3 miR-149-3p調(diào)控H9c2心肌細胞胰島素刺激的糖攝取 2-NBDG熒光吸收強度檢測結(jié)果表明，HGHF組細胞胰島素刺激的糖攝取顯著降低(圖3A)。轉(zhuǎn)染miR-149-3p mimic后，胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著高于對照組(圖3A)。轉(zhuǎn)染miR-149-3p inhibitor后，胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著低于對照組(圖3B)。

圖3 miR-149-3p對H9c2心肌細胞胰島素刺激的糖攝取作用

2.4 miR-149-3p通過抑制FTO水平負性調(diào)節(jié)胰島素信號通路 在線網(wǎng)站TargetScan顯示FTO和miR-149-3p具有結(jié)合位點(圖4A)。應(yīng)用real-time qPCR實驗和western blot實驗檢測FTO的表達情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-149-3p mimic后，細胞中FTO表達顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-149-3p inhibitor后，細胞中FTO的表達情況顯著升高(圖4B和4C)。

圖4 miR-149-3p對FTO的調(diào)控作用

3.討論

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[7,8]。胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特點，胰島素抵抗狀態(tài)下心肌細胞利用葡萄糖出現(xiàn)障礙，心肌細胞脂肪酸氧化代謝增強，心肌細胞凋亡率增加，從而引起心臟收縮功能障礙，此外，其可在心肌缺血再灌注損傷中引起左室功能恢復受抑制[9,10]。

隨著人們對miRNAs的深入研究，越來越多的報道表明，miRNAs能夠廣泛參與諸多生命活動[11]。研究報道m(xù)iR-149-3p能夠抑制膀胱癌、宮頸癌、非小細胞肺癌等癌癥細胞的增殖和遷移等，且其能夠調(diào)控脂代謝[12]，但未有研究報道其在糖代謝等方面是否發(fā)揮作用。此外，研究表明，miR-149-3p能夠通過抑制FTO抑制脂代謝[13]。因此，我們猜想miR-149-3p可能在糖代謝方面也發(fā)揮一定的作用。

本研究中，糖尿病模型組大鼠腹腔注射糖耐量實驗中2h血糖顯著高于對照組，糖尿病模型組大鼠血漿TC、TG和FFA水平均顯著高于對照組。real-time qPCR實驗結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠心肌中miR-149-3p的表達顯著降低。過表達miR-149-3p的水平可以一定程度恢復胰島素刺激的糖攝取，敲減miR-149-3p的水平可以一定程度抑制胰島素刺激的糖攝取，提示miR-149-3p可能參與了高糖高脂誘導的胰島素敏性的改變。轉(zhuǎn)染miR-149-3p mimic即可提高細胞對胰島素的響應(yīng)能力，而轉(zhuǎn)染miR-149-3p inhibitor即可降低細胞對胰島素的響應(yīng)能力。進一步研究表明miR-149-3p可以通過下調(diào)FTO降低心肌細胞對胰島素的敏感性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示miR-149-3p在糖尿病大鼠的心臟中表達水平降低，且其可通過下調(diào)FTO降低心肌細胞對胰島素的敏感性，本研究為胰島素抵抗相關(guān)疾病的診斷及治療提供了新的思路。