姜娜,楊曉飛,李瑛,王光東,魏鑫

目前國內(nèi)約60%的肝癌患者多由慢性乙型肝炎進(jìn)展所致，稱為乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌；而乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)存在乙肝病毒感染狀態(tài)與惡性腫瘤狀態(tài)，接受抗腫瘤治療過程中易出現(xiàn)病毒激活現(xiàn)象，病毒激活后會誘發(fā)機(jī)體免疫損傷，使肝臟炎癥反應(yīng)加重，導(dǎo)致肝硬化進(jìn)程加快[1-2]。而乙肝病毒屬非致細(xì)胞病變DNA病毒，經(jīng)結(jié)合漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)表面Toll樣受體9(Toll like receptor 9，TLR9)，誘導(dǎo)依賴髓樣分化因子信號通路激活，促使機(jī)體免疫反應(yīng)被啟動[3]。有報道認(rèn)為機(jī)體免疫缺陷與病毒持續(xù)性存在有關(guān)，尤其是DC與TLR9信號通路分子障礙會誘發(fā)病毒持續(xù)性感染，而激活TLR9信號通路相關(guān)分子對病毒復(fù)制具有一定抑制作用[4]。但目前鮮有報道探討TLR9信號通路分子與乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒激活的關(guān)系，故本文展開相關(guān)研究，旨在為該病治療提供參考依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年4月至2019年4月于西安市第八醫(yī)院肝病科及空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院傳染科收治的102例接受手術(shù)治療的乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者為對象，獲兩院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。按術(shù)后病毒激活情況分為激活組(30例)和未激活組(72例)，其中激活組男24例，女6例，年齡18～74(51.25±4.89)歲；腫瘤大?。骸? cm 24例，>5 cm 6例；分化程度：Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ～Ⅳ期21例。未激活組男45例，女27例，年齡20～75(52.03±5.20)歲；腫瘤大?。骸? cm 46例，>5 cm 26例；分化程度：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期51例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌診斷：慢性乙肝診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[5]，乙型肝炎病程持續(xù)6個月以上；乙肝表面抗原攜帶者再次出現(xiàn)肝炎癥狀、體征，其它病因排外。肝細(xì)胞性肝癌診斷參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》[6]，甲胎蛋白低于400 μg/L，且至少有兩種影像學(xué)檢查(如磁共振成像、腹部B超等)示肝細(xì)胞性肝癌；甲胎蛋白高于400 μg/L，且至少有一種影像學(xué)檢查示肝癌占位性病變。同時符合以上兩者即可確診為乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌。②年齡≥65歲。③所有患者腫瘤均可切除，均接受手術(shù)治療。④肝功能Child-Pugh分級A級。⑤血清乙型肝炎病毒DNA低于102IU/mL。⑥入組前3個月內(nèi)未行其他抗腫瘤治療。⑦知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①伴心、肝、腎、肺等重要臟器功能不全；②精神疾患；③術(shù)后病理確診為非肝細(xì)胞性肝癌；④圍術(shù)期非肝功衰竭致死亡者。

1.3 方法

1.3.1 手術(shù)治療 所有手術(shù)均由同一組手術(shù)醫(yī)生完成。術(shù)前行常規(guī)檢查，取平臥位，麻醉成功后采用安爾碘行術(shù)區(qū)皮膚消毒處理，并使用消毒手術(shù)薄膜覆蓋。留取右肋緣下切口(長約8 cm)，皮膚切開后逐層進(jìn)腹。待探查后明確肝臟腫瘤切除術(shù)式?；颊咄ǔＳ谛g(shù)后10 d左右出院，待出院后以門診復(fù)查或電話等形式隨訪6個月，分析術(shù)后病毒激活等情況。病毒激活判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：①血清乙型肝炎病毒DNA載量升高≥1 log10IU/mL，且血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高2～3倍；②既往乙型肝炎E抗原或乙肝表面抗原陽性經(jīng)治療后呈陰性，且伴乙肝病毒核心抗體陽性，血清學(xué)中表面抗原重新逆轉(zhuǎn)呈陽性。滿足以上任意一項即可確診為病毒激活。

1.3.2 外周血單個核細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞及TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)檢測 分別于術(shù)前及術(shù)后1周采集清晨肝素抗凝外周血12 mL，行外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)及TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)檢測。

(1)PBMC：滴管取靜脈血10 mL置入50 mL離心管中，加入室溫磷酸鹽緩沖液10 mL，吹打混勻。將淋巴細(xì)胞分離液20 mL置入另50 mL離心管中，離心管傾斜45°，距分離液界面約1.0 cm處順著管壁滴入已稀釋好的靜脈血，2 000 rpm/min離心30 min。離心后采用1 mL針管吸取白膜層[上層(血漿與大部分血小板)與中層(淋巴細(xì)胞分離液)交界部位有一白膜層，即為PBMC]，置入10 mL離心管中，以5倍體積的磷酸鹽緩沖液重懸，1 000 rpm/min離心10 min，棄上清后重復(fù)洗滌，以Buffer重懸PBMC，定容1 mL，計數(shù)。

(2)pDCs：計數(shù)PBMC，100 μL Buffer重懸細(xì)胞，敷BDCA2 PE 10 μL，4 ℃冰箱保存10 min。2 mL Buffer洗細(xì)胞，300 g離心10 min，后棄上清，再次洗細(xì)胞并離心。加入80 μL Buffer使細(xì)胞重懸，置入Anti-PE Micro Beads 20 μL后混勻，4 ℃冰箱保存15 min。加入2 mL Buffer洗細(xì)胞，300 g離心10 min，后棄上清將細(xì)胞重懸至500 μL。于磁場中置入MS Separation columns，利用500 μL Buffer對柱子進(jìn)行3次沖洗，將細(xì)胞懸液吸至柱中，待濾過后再次沖洗柱子，自磁場中取出柱子，與EP管相連，并置入1 mL Buffer，配套注射器打出。

(3)TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)：按照RNAprep Pure細(xì)胞總RNA抽取試劑盒(北京天根生物有限公司)說明書行RNA抽提，采用Nanodrop分光光度計(北京百道亨儀器設(shè)備有限公司)測定RNA濃度和OD值(OD260/OD280保證在1.8～20.0之間)。取等量RNA量置入0.5 μL微量離心管中，加DEPC水13.2 μL，并加入10×RT Buffer 2.0 μL、25×dNTP Mix 0.8 μL、10×RT Random Primers 2.0 μL，混合均勻后70 ℃加熱持續(xù)5 min變性。后加入Multi ScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL及RNase Inhibitor 1.0 μL，混均后行逆轉(zhuǎn)錄(25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃∞)。后稀釋引物(引物終濃度50 μmol/L)，在各管中添加入相關(guān)試劑(總體積20 μL，上下游引物各1.0 μL，ROX 0.8 μL，SYBA 10.0 μL，cDNA 2 μL，H2O 6.2 μL)，兩步法行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Step1：95 ℃10 min；Step2×40：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；Melt Curve：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)，后獲取CT值，計算2-ΔΔCT。檢測TLR9、髓樣分化因子88(myloid differentiation factor 88，MyD88)、白介素1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(TNF-receptor-associated factor 6，TRAF6)、轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)的mRNA表達(dá)水平。

1.3.3 外周血血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-α(interferon-α，IFN-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素12(interleukin-12，IL-12)水平，試劑盒均由上海萊茲生物有限公司提供。

1.3.4 腫瘤組織及癌旁組織中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)檢測

(1)實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)：取肝臟組織20 mg，磷酸鹽緩沖液沖洗后加入1 mL Trizol試劑(美國Thermo公司)，Trizol法提取樣本總RNA，行RNeasy Mini Kit純化。采用Nanodrop分光光度計測定RNA濃度和OD值(OD260/OD280確保在1.8～20.0之間)。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及聚合酶鏈反應(yīng)同外周血TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)檢測。

(2)免疫組織化學(xué)：自病理科取石蠟切片置入60 ℃烘片機(jī)，持續(xù)20 min。經(jīng)二甲苯脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、封閉、顯色、蘇木精復(fù)染、脫水等處理后封片。

(3)蛋白質(zhì)提取：取-80 ℃保存的組織 50 mg，磷酸鹽緩沖液沖洗后剪碎，加入Ripa 200 μL+蛋白酶抑制2 μL+PMSF 2 μL后漩渦振蕩，冰上搖床30 min。15 000 rpm/min離心5 min后取上清，置入另一空離心管中，以BCA 蛋白濃度法檢測樣品中蛋白濃度。5×SDS-PAGE緩沖液加入后混勻，沸水持續(xù)煮10 min，冷卻后置入-80 ℃冰箱。

(4)蛋白免疫印跡：按蛋白濃度計算體積后點樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、敷一抗、ECL發(fā)光液檢測、曝光處理后顯影定影。

1.4 觀察指標(biāo)

分析兩組手術(shù)前后外周血PBMC、DC數(shù)目及血漿中細(xì)胞因子表達(dá)水平，探討手術(shù)前后外周血pDCs中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平，并觀察兩組腫瘤組織及癌旁組織中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平，分析癌旁組織中TLR9及相關(guān)分子蛋白表達(dá)情況與病毒激活的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組手術(shù)前后外周血PBMC、DC數(shù)目比較

激活組手術(shù)前后外周血PBMC、DC數(shù)目較未激活組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1兩組手術(shù)前后外周血PBMC、DC數(shù)目比較

2.2 兩組手術(shù)前后外周血pDCs中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平比較

激活組術(shù)前MyD88、IRF7的mRNA 表達(dá)水平均顯著低于未激活組(P<0.05)；兩組術(shù)后TLR9信號通路分子(TLR9、MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1、IRF7)mRNA 表達(dá)水平均顯著低于術(shù)前(P<0.05)；激活組術(shù)后TLR9、TRAF6、TAK1、IRF7的mRNA 表達(dá)水平均顯著低于未激活組(P<0.05)，見表2。

表2兩組手術(shù)前后外周血pDCs中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平比較 [M(Q1, Q3)]

注：與同組術(shù)前比較，#P<0.05

2.3 兩組手術(shù)前后外周血血漿中細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

兩組術(shù)后IL-6均顯著高于術(shù)前(P<0.05)，且未激活組術(shù)后TNF-α顯著高于術(shù)前(P<0.05)；激活組術(shù)后TNF-α顯著低于未激活組(P<0.05)，見表3。

2.4 兩組腫瘤組織中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平比較

激活組腫瘤組織中TLR9、MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1、IRF7分子mRNA 表達(dá)水平較未激活組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

2.5 兩組癌旁組織中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平比較

激活組癌旁組織中TLR9 mRNA 表達(dá)水平顯著高于未激活組(P<0.05)，其他分子mRNA表達(dá)水平較未激活組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表3兩組手術(shù)前后外周血血漿中細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

注：與同組術(shù)前比較，#P<0.05

表4兩組腫瘤組織中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平比較 [M(Q1, Q3)]

表5兩組癌旁組織中TLR9信號通路分子mRNA表達(dá)水平比較 [M(Q1, Q3)]

2.6 癌旁組織中TLR9及相關(guān)分子蛋白表達(dá)情況與病毒激活的關(guān)系

經(jīng)檢測癌旁組織TLR9及相關(guān)分子蛋白(MyD88、IRF7)水平，以免疫組化方法驗證其是否表達(dá)于癌旁組織中，后以Western Blotting檢測方法檢驗病毒激活與癌旁組織中上述分子蛋白表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果顯示，TLR9、MyD88、IRF7均表達(dá)于肝臟癌旁組織中，其中TLR9呈強陽性，MyD88呈陽性，IRF7呈弱陽性(圖1)；蛋白免疫印跡顯示，未激活組癌旁組織中TLR9蛋白表達(dá)水平較激活組明顯下降(圖2)。

圖1免疫組化檢測癌旁組織中TLR9及相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平(×100) A：TLR9；B：MyD88；C：IRF7

圖2蛋白免疫印跡檢測兩組癌旁組織中TLR9及相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平 1-4 激活組；5-8 未激活組；A：TLR9；B：MyD88；C：IRF7

3 討論

據(jù)報道，國內(nèi)屬乙肝病毒感染高流行區(qū)，90%人群感染乙肝病毒后呈隱形感染狀態(tài)或自行恢復(fù)，部分患者感染后進(jìn)展為慢性纖維化、肝癌[8-9]。分析乙肝病毒激活原因，有報道認(rèn)為與機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡導(dǎo)致肝臟表面病毒復(fù)制增多有關(guān)，其中DC、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與患者機(jī)體免疫反應(yīng)，成纖維細(xì)胞、庫否細(xì)胞等肝臟內(nèi)其它細(xì)胞也參與清除乙肝病毒免疫反應(yīng)[10]。另有報道發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒經(jīng)DC表面TLR9被機(jī)體識別，使MyD88分子信號通路被激活，誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，其中DC起著重要作用[11]。

本研究結(jié)果顯示，激活組手術(shù)前后外周血PBMC、DC數(shù)目與未激活組并無明顯變化，與龍建云等[12]報道相似。張卡等[13]發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者DC、PBMC數(shù)目與正常人無明顯差異。筆者推測，乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒復(fù)制及激活與PBMC、DC數(shù)目改變無關(guān)，可能與DC細(xì)胞功能障礙相關(guān)，推測DC上TLR9信號通路分子可能參與乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒激活過程。

本研究結(jié)果顯示，激活組術(shù)前MyD88、IRF7的mRNA 表達(dá)明顯低于未激活組，術(shù)后TLR9、TRAF6、TAK1、IRF7的mRNA 表達(dá)明顯低于未激活組，提示外周血pDCs中TLR9信號通路分子可能參與乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒激活過程。分析其原因，筆者認(rèn)為，TLR9往往高表達(dá)于PBMC、DC上，在病原體識別、免疫激活中發(fā)揮著重要意義；而血清乙肝病毒DNA結(jié)合DC上TLR9，可使MyD88信號通路和P38MAPK通路被激活，上調(diào)IRF7調(diào)節(jié)因子，誘發(fā)前炎癥因子及細(xì)胞因子釋放，實現(xiàn)病毒清除作用。以往報道發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者外周血中DC細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且存在功能障礙，pDCs中TLR9 mRNA表達(dá)低于正常水平，伴IFN-α減少[14]。Dong T等[15]報道TLR9激動劑能抑制病毒復(fù)制，與本結(jié)論類似，預(yù)示外周血TLR9 mRNA高表達(dá)者術(shù)后病毒激活風(fēng)險低。而MyD88屬TLR9信號通路下游關(guān)鍵分子，經(jīng)蛋白-蛋白結(jié)構(gòu)連接IL-IR相關(guān)激酶家族IRAK后誘發(fā)一系列功能性分子釋放。既往報道也認(rèn)為術(shù)前MyD88 mRNA表達(dá)減少與慢性乙肝患者術(shù)后病毒激活相關(guān)[16]。Zhang X等[17]報道MyD88能使HepG2.2.15肝細(xì)胞系與乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠上病毒復(fù)制受抑，下調(diào)MyD88表達(dá)會導(dǎo)致IFN-α對病毒復(fù)制的抑制作用減弱。TAK1、TRAF6屬TLR9信號通路分子下游環(huán)節(jié)，上述靶基因缺陷會使TLR9所致TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-12釋放受抑[18]。而IRF7屬TLR9信號通路中最后作用分子，乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者手術(shù)前后pDCs中IRF7表達(dá)減少與病毒激活密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，未激活組術(shù)后TNF-α顯著較術(shù)前高，且TNF-α明顯低于未激活組，提示乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后TNF-α分泌減少與術(shù)后病毒激活有關(guān)。分析原因，乙肝病毒激活多因機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡所致肝臟表面病毒復(fù)制增多，如乙肝表面抗原陽性腫瘤者化療時淋巴細(xì)胞功能受抑，TNF-α分泌減少。喻一奇等[19]發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕性疾病合并乙肝病毒感染者免疫抑制治療后存在病毒激活現(xiàn)象。筆者推測，乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒激活過程中，腫瘤壞死因子可能發(fā)揮著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，激活組腫瘤組織中TLR9信號通路分子mRNA 表達(dá)較未激活組并無明顯變化，而激活組癌旁組織中TLR9 mRNA 表達(dá)明顯高于未激活組，證實癌旁組織中TLR9高表達(dá)是患者術(shù)后病毒激活的高危因素。既往報道認(rèn)為，惡性腫瘤中DC等免疫細(xì)胞上表達(dá)的TLR對機(jī)體固有免疫、適應(yīng)性免疫具有調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞因子大量釋放；而腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的TLR能確保腫瘤細(xì)胞躲避宿主監(jiān)視[20-21]。筆者推測，癌旁組織中TLR9表達(dá)可能對乙肝病毒逃脫宿主監(jiān)視具有保護(hù)作用，基于機(jī)體免疫力下降后誘發(fā)病毒激活。本研究中，兩組癌旁組織中MyD88信號通路分子表達(dá)并無明顯改變，推測肝臟組織中TLR9并非經(jīng)MyD88信號通路誘發(fā)機(jī)體炎癥因子分泌。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白免疫印跡示未激活組癌旁組織中TLR9蛋白表達(dá)水平較激活組明顯下降，進(jìn)一步證實乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒激活與癌旁組織中TLR9高表達(dá)有關(guān)，手術(shù)應(yīng)激后乙肝病毒被釋放入血，TLR9表達(dá)低者細(xì)胞因子表達(dá)水平較低，無法應(yīng)對機(jī)體反應(yīng)，易導(dǎo)致病毒復(fù)制增多。

綜上，TLR9信號通路分子與乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者術(shù)后病毒激活有關(guān)，其具體機(jī)制尚需大規(guī)模樣本研究驗證。