戰(zhàn)雪燕，聶 政，趙陽(yáng)楠，羅曉瑩，李慕曉，安曉夢(mèng)，敖陽(yáng)思琦，崔 杰，王 森，賀 蘭，趙俊龍

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢430070）

吉氏巴貝斯蟲(chóng)是一種寄生于犬紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲(chóng)，主要傳播媒介是長(zhǎng)角血蜱。犬感染后主要表現(xiàn)為貧血、發(fā)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生血紅蛋白尿甚至死亡。吉氏巴貝斯蟲(chóng)的蟲(chóng)體在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)中相對(duì)較小，大小約1μm×3 μm。蟲(chóng)體一般在紅細(xì)胞邊緣呈單個(gè)存在，也有多個(gè)同時(shí)存在的現(xiàn)象，其中多數(shù)呈環(huán)形[1]。自1910年吉氏巴貝斯蟲(chóng)首次在印度被發(fā)現(xiàn)后，隨后在澳大利亞、亞洲甚至歐洲國(guó)家相繼被報(bào)道[2,3]。研究表明，吉氏巴貝斯蟲(chóng)可以通過(guò)蜱蟲(chóng)傳播、血液接觸傳播和胎盤(pán)傳播[4,5]。

1985年，我國(guó)南京市首次報(bào)道犬感染巴貝斯蟲(chóng)[6,7]。目前，犬巴貝斯蟲(chóng)在我國(guó)呈廣泛性流行。韋氏巴貝斯蟲(chóng)主要流行于浙江省、廣東省和重慶市等地區(qū)，而犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)主要分布于江蘇省、河南省和安徽省等地[8]。2017年賀蘭等[9]報(bào)道了吉氏巴貝斯蟲(chóng)武漢株，并提供18s rRNA和ITS基因序列等分子生物學(xué)證據(jù)，從進(jìn)化角度證實(shí)犬巴貝斯蟲(chóng)在武漢市的流行。

寄生蟲(chóng)的表面蛋白質(zhì)是宿主-寄生蟲(chóng)相互作用中宿主免疫應(yīng)答的主要靶標(biāo)，是疫苗開(kāi)發(fā)的理想候選者，寄生蟲(chóng)的表面抗原是亞單位疫苗的合理靶標(biāo)。在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)中，已經(jīng)被鑒定的表面抗原包括多種糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定相關(guān)蛋白，例如瘧原蟲(chóng)的MSP家族[10,11]、弓形蟲(chóng)的SAG家族等[12]。巴貝斯科中也鑒定出多個(gè)GPI錨定蛋白，例如田鼠巴貝斯蟲(chóng)鑒定出19個(gè)GPI錨定蛋白，牛巴貝斯蟲(chóng)鑒定出17個(gè)GPI錨定蛋白[13,14]，而犬巴貝斯蟲(chóng)同樣存在GPI錨定蛋白如Bc28家族等[13]。GPI錨定蛋白序列的N端都有一個(gè)疏水的信號(hào)肽，指導(dǎo)蛋白共翻譯并插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，C端包含1個(gè)GPI錨定位點(diǎn)，指導(dǎo)GPI的附著作用，在共翻譯插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜期間，C末端疏水區(qū)被轉(zhuǎn)酰胺酶復(fù)合物識(shí)別，同時(shí)去除疏水區(qū)并用預(yù)先合成的GPI錨代替[15]。GPI的主要結(jié)構(gòu)包括一個(gè)肌醇、N-乙酰氨基葡萄糖以及通常經(jīng)由磷酸乙醇胺與蛋白質(zhì)的C末端連接的3個(gè)甘露糖基團(tuán)。GPI錨定蛋白的親水性比較強(qiáng)，因此也是很好的疫苗候選因子和藥物靶標(biāo)。

吉氏巴貝斯蟲(chóng)對(duì)寵物的危害嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在病原學(xué)、流行病學(xué)、分子生物學(xué)以及診斷學(xué)等方面均對(duì)吉氏巴貝斯蟲(chóng)進(jìn)行了大量的研究。研究表明有一類通過(guò)GPI錨定在吉氏巴貝斯蟲(chóng)表面的蛋白，這類蛋白暴露在蟲(chóng)體表面，可中和宿主體內(nèi)的抗體，因此是很好的候選診斷標(biāo)識(shí)疫苗因子。目前已報(bào)道的吉氏巴貝斯蟲(chóng)表面抗原包括BgP22、BgP32、BgP47、BgP50等，但僅限于ELISA檢測(cè)應(yīng)用。雖然BgP50具有免疫保護(hù)性作用，但是并未被深入研究[16-18]。

本研究通過(guò)對(duì)NCBI、PiroplasmaDB的搜索，獲得吉氏巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定相關(guān)蛋白基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)每個(gè)GPI錨定相關(guān)蛋白的性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)、氨基酸殘基組成、疏水性、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位以及同源性分析等，為此相關(guān)研究提供理論依據(jù)，并為開(kāi)發(fā)敏感性、特異性和高度自動(dòng)化的吉氏巴貝斯蟲(chóng)病診斷方法提供潛在的檢測(cè)標(biāo)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 吉氏巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定相關(guān)蛋白基因的搜索以及確定運(yùn)用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Uniprot（http://www.uniprot.org/）以及PiroplasmaDB（http://piroplasmadb.org/piro/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，確定田鼠巴貝斯蟲(chóng)以及牛巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定相關(guān)蛋白基因序列及其氨基酸序列，然后使用生物信息學(xué)的方法對(duì)吉氏巴貝斯蟲(chóng)的基因庫(kù)進(jìn)行搜索，從而確定吉氏巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定相關(guān)蛋白的基因序列。將得到的蛋白序列使用bigPI（http://mendel.imp.ac.at/gpi/plant_server.htm），PredGPI（http://gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi/），GPI-SOM（http://gpi.unibe.ch/）預(yù)測(cè)GP錨定位點(diǎn)，證實(shí)其確實(shí)是GPI錨定蛋白。

1.2 GPI錨定相關(guān)蛋白性質(zhì)的預(yù)測(cè)分析利用ExPASy-PortParam （https://web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站對(duì)相關(guān)蛋白的分子量、氨基酸組成、等電點(diǎn)以及消光系數(shù)等基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用ExPASy-ProtScale （https://web.expasy.org/protscale/）選擇Hphob./Kyte&Doolittle法對(duì)其疏水性進(jìn)行分析；通過(guò)TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站分析其跨膜區(qū)；SignalP 4.1 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）網(wǎng)站可以預(yù)測(cè)其信號(hào)肽；使用TargetP （http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；通過(guò)DNASTAR分析其B淋巴細(xì)胞抗原表位；使用motif scan網(wǎng)站對(duì)蛋白修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 GPI錨定相關(guān)蛋白基因的檢索以及序列分析首先在PiroplasmaDB網(wǎng)站中搜索到田鼠巴貝斯蟲(chóng)的19個(gè)GPI錨定蛋白以及牛巴貝斯蟲(chóng)的17個(gè)GPI錨定蛋白基因。分別使用不同的GPI錨定蛋白氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上公布的吉氏巴貝斯蟲(chóng)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（表1），然后將其與武漢株吉氏巴貝斯蟲(chóng)基因組序列作比較，最終得到5個(gè)潛在GPI錨定相關(guān)蛋白基因序列，分別命名為BgP50-WH、BgP47-WH、BgP45-WH、BgP32-WH和BgP12-WH，經(jīng)過(guò)網(wǎng)站預(yù)測(cè)證實(shí)為GPI錨定蛋白（表1、2），氨基酸序列如圖1。

2.2 GPI錨定相關(guān)蛋白的理化性質(zhì)（以BgP50-WH為例）

2.2.1 基本理化性質(zhì) 通過(guò)ExPASy-PortParam工具發(fā)現(xiàn)，BgP50-WH共有471個(gè)氨基酸（圖1），分子質(zhì)量為50.616 kDa，等電點(diǎn)為8.92，富含丙氨酸Ala、Leu、Val、Lys等氨基酸，蛋白分子式為C2272H3590N596O678S16。在體外哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)半衰期是30 h，而脂肪指數(shù)是80.62，不穩(wěn)定系數(shù)為21.21，由此可視為穩(wěn)定蛋白。平均親水系數(shù)是-0.122，可視為親水性蛋白質(zhì)。

表1 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中吉氏巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白Table 1 GPI-anchored protein of Babesia gibsoni in the NCBI database

表2 武漢株吉氏巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Predicted GPI-anchored proteins of Babesia gibsoni from Wuhan

2.2.2 疏水性分析 通過(guò)ExPASy-ProtScale，選擇Hphob./Kyte&Doolittle法對(duì)其疏水性進(jìn)行分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖2，蛋白整體親水性較強(qiáng)。

2.2.3 跨膜區(qū)分析 跨膜區(qū)指的是蛋白氨基酸序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，α-螺旋結(jié)構(gòu)最為常見(jiàn)，約20～25個(gè)氨基酸殘基。構(gòu)成跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)氨基酸大部分是疏水性氨基酸。若蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)，提示其作用可能為膜受體，也可視為在生物膜上的錨定蛋白或者離子通道蛋白。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域的分析常采用TMHMM軟件進(jìn)行，它對(duì)于可溶性蛋白和膜蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)，該蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)。

2.2.4 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)通常使用SignalP 4.1 server，該網(wǎng)站主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真核生物，而吉氏巴貝斯蟲(chóng)屬于真核生物，因此結(jié)果具有很大的可靠性。C-score為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)分值，S-score為信號(hào)肽位點(diǎn)分值，Y-score為綜合位點(diǎn)剪切分值。結(jié)果顯示，C-score、S-score值、Y-score三值波動(dòng)幅度較大，且三值均有突出值，其切割位點(diǎn)在第19個(gè)和第20個(gè)氨基酸之間，判斷該蛋白有信號(hào)肽。

圖1 吉氏巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of GPI-anchored protein from Babesia gibsoni

圖2 BgP50親水性/疏水性分析Fig.2 Hydrophilicity/Hydrophobicity analysis of BgP50-WH

圖3 BgP50-WH跨膜區(qū)分析Fig.3 Transmembrane region prediction of BgP50-WH

圖4 BgP50-WH信號(hào)肽分析Fig. 4 Signal peptide prediction of BgP50-WH

2.2.5 亞細(xì)胞定位 預(yù)測(cè)真核蛋白亞細(xì)胞定位通常使用TargetP，經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)，該蛋白的SP值為0.875，結(jié)果與信號(hào)肽預(yù)測(cè)一致，即可能分泌到細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞外。

圖5 BgP50-WH亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Fig. 5 Subcellular localization prediction of BgP50-WH

表3 BgP50-WH的B淋巴細(xì)胞抗原表位氨基酸序列Table 3 Position and sequences of potential B cell antigen epitopes

2.2.7 修飾性位點(diǎn)預(yù)測(cè) 蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)通常使用motif scan網(wǎng)站，將BgP50氨基酸輸入網(wǎng)站后，結(jié)果顯示BgP50氨基酸序列存在酪蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn)10個(gè)，N-?；稽c(diǎn)5個(gè)，蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，N-糖基化位點(diǎn)2個(gè)（表4）。

3 討論

GPI錨定蛋白在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵及其在生物體內(nèi)生存過(guò)程中具有重要的作用。GPI錨定蛋白最終被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面并且經(jīng)常參與識(shí)別、粘附和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[19]。在瘧原蟲(chóng)中，GPI錨定蛋白主要為MSP家族，CSP蛋白和MSP-1、MSP-2蛋白是主要研究對(duì)象，它們具有高度變異性以及很好的免疫原性[10,11]。弓形蟲(chóng)中GPI錨定蛋白的主要研究對(duì)象為SAG家族，SAG1在蟲(chóng)體入侵前起黏附作用。研究表明帶有SAGs基因的腺病毒免疫小鼠可抑制弓形蟲(chóng)入侵[12]，運(yùn)用SAG1建立的ELISA方法用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染在臨床上取得了很好的效果[20,21]。牛巴貝斯蟲(chóng)中主要研究集中于VMSA家族基因，它在子孢子和裂殖子時(shí)期都有表達(dá)。魏金龍等[22]結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究總結(jié)出VMSA家族對(duì)蟲(chóng)體入侵紅細(xì)胞具有重要作用。體外抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VMSA家族基因?qū)ε０拓愃瓜x(chóng)入侵起到中和作用[13,23]。研究人員采用MSA-2c建立了ELISA方法，并成功用于臨床檢測(cè)[24]。對(duì)田鼠巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，BmGPI12對(duì)其抗體具有高度親和力，在所有田鼠巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白中靈敏性和特異性最高，有望成為新的檢測(cè)標(biāo)識(shí)以及藥物靶標(biāo)[25]。犬巴貝斯蟲(chóng)（Babesia canins）Bc28多基因家族至少包含Bc28. 1和同源Bc28. 2基因，兩個(gè)基因相對(duì)保守，作為裂殖子表面基因起著至關(guān)重要的作用[26-28]。由此可見(jiàn)，巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白是巴貝斯蟲(chóng)入侵宿主紅細(xì)胞重要分子之一，同樣也是診斷抗原及疫苗研制的重要候選分子之一。目前對(duì)于吉氏巴貝斯蟲(chóng)尚未有相關(guān)GPI錨定蛋白的報(bào)道，但早在多年前P50便作為蟲(chóng)體表面蛋白被報(bào)道，是血清學(xué)診斷的重要分子之一，可以有效檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)犬感染后d8的IgG。吉氏巴貝斯蟲(chóng)面臨的一個(gè)很重要的難題在于感染早期的蟲(chóng)體檢測(cè)。臨床上常采用血涂片對(duì)吉氏巴貝斯蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)，但這種方法敏感性低，早期感染階段無(wú)法檢出。PCR、間接免疫熒光檢測(cè)以及ELISA檢測(cè)技術(shù)的特異性和靈敏性不穩(wěn)定，適用范圍有限。楊其清等[29]使用截短BgTRAP作為診斷抗原初步建立的ELISA，為研發(fā)相關(guān)試劑盒提供了一定的理論基礎(chǔ)，但仍然需要開(kāi)發(fā)通用的抗原進(jìn)行早期IgM檢測(cè)，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的[9,30-33]。

目前關(guān)于巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白的研究相對(duì)較少，不同巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白不僅數(shù)量不同，并且沒(méi)有相似的結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致不同種屬的巴貝斯蟲(chóng)GPI錨定蛋白命名混亂，給科研以及搜索造成了不同程度的困難。與傳統(tǒng)方法相比，生物信息學(xué)具有高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)，在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和其他生物學(xué)特性方面變得越來(lái)越重要。本研究使用多種生物信息學(xué)的方法對(duì)NCBI上吉氏巴貝斯蟲(chóng)基因進(jìn)行篩選。最終確定5個(gè)GPI錨定相關(guān)蛋白，分別命名為BgP50-WH、BgP47-WH、BgP45-WH、BgP32-WH和BgP12-WH。這5個(gè)GPI錨定蛋白均含有信號(hào)肽、跨膜區(qū)以及含有較多的抗原表位。B淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)在誘導(dǎo)GPI錨定蛋白獲得免疫性應(yīng)答中起到非常重要的作用。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)未知蛋白的免疫原性，并鑒定適合于疫苗開(kāi)發(fā)的抗原表位具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)BgP47-WH，BgP50-WH與抗體親和力較強(qiáng)，有望成為新的診斷標(biāo)識(shí)。本研究確定的5個(gè)GPI錨定蛋白很有可能成為檢測(cè)吉氏巴貝斯蟲(chóng)的特異性診斷抗原，并為阻止吉氏巴貝斯蟲(chóng)的入侵提供了藥物靶標(biāo)和疫苗候選因子。

圖6 BgP50-WH抗原表位預(yù)測(cè)Fig. 6 Potential B cell antigen epitopes prediction of BgP50-WH

表4 BgP50-WH氨基酸序列修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Post-translational modification （PTM） sites of the putative BgP50-WH