王瑞娜，郭紅亮，朱海峰，高 偉

(西安市第一醫(yī)院；西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院；西安市眼科醫(yī)院；陜西省眼科研究所，陜西西安710002)

真菌性角膜炎是一種嚴(yán)重?fù)p害視功能的感染性角膜病變。近年來由于激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，器官移植的普遍開展，全身性及局部真菌感染日益增多。曲霉菌感染是我國大部分地區(qū)最常見的絲狀菌之一。兩性霉素B是治療曲霉菌感染的首選藥物。但是一直以來，由于全身應(yīng)用副作用大，眼部應(yīng)用生物利用度低，刺激性大，病人依從性差等原因使其在真菌性角膜炎的治療中受到很大限制。本研究的目的在于觀察兩性霉素B脂質(zhì)體(Liposomal amphoterich B,LAmB)局部應(yīng)用的吸收率和生物利用度，以提高曲霉菌性角膜炎的療效。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(Waters公司)，Quattro Premier Micromass質(zhì)譜儀(Waters公司)，Masslynx4.1軟件操作系統(tǒng)，CR21F型高速低溫離心機(jī)(日本日立公司)，TurbovapLV濃縮儀(Zymark公司)。

1.2 藥品、試劑及動(dòng)物

甲醇與乙腈(農(nóng)殘級(jí)，TEDIA公司)。白藜蘆醇購自中國藥品生物制品檢定所(純度>99%)。普通級(jí)健康新西蘭白兔105只(購自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，雌雄各半，兔齡46個(gè)月，體重2.0～3.0 kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)制劑的準(zhǔn)備

1.3.1 0.5%LAmB及0.25%LAmB的制備 用上海新先鋒藥業(yè)公司的兩性霉素B脂質(zhì)體靜脈用粉針劑10 mg，加滅菌注射用水2 mL或4 mL，充分混勻，直至呈黃色均勻液體。

1.3.2 0.5%AmB的制備 用華北制藥公司兩性霉素B靜脈用粉針劑25 mg，加入滅菌注射用水5 mL，充分混勻，直至呈黃色均勻液體。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

兔眼應(yīng)用兩性霉素B脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)白兔隨機(jī)分5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組21只；每次實(shí)驗(yàn)用一組，再將21只白兔隨機(jī)分為3組，對(duì)每只白兔左眼采用角膜“#”形劃痕作兔實(shí)驗(yàn)性曲霉菌性角膜潰瘍模型，分別應(yīng)用0.5%LAmB，0.25%LAmB，0.5%AmB點(diǎn)眼，每15 min點(diǎn)眼一次，共4次，每次50 μL，用藥后5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，取每只白兔房水標(biāo)本用1 mL注射器在透明角膜周邊部斜行穿刺抽取100 μL房水送檢，并同時(shí)取下角膜組織備用，標(biāo)本中混有血液的棄用，并補(bǔ)充新的動(dòng)物。

2.2 房水標(biāo)本的處理及房水和角膜中AmB的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由于房水和角膜片中的內(nèi)源性物質(zhì)可對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生干擾，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。取0.2 mL空白房水液，配制不同濃度的Amphotericin B標(biāo)準(zhǔn)溶液1，10，20，50，200 ng/mL(含內(nèi)標(biāo)Resveratrol，10 ng/mL)，混勻，加乙酸乙酯2 mL，渦流混合1 min，3000 r/min離心，提取2次，合并提取液置于尖底試管中，于55℃ N2吹干，殘留物加入50 μL甲醇溶解，渦流混合1 min，取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖(見封二圖1)。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，求得工作曲線回歸方程。取空白的角膜片，機(jī)械勻漿，制備組織懸液，依照上述同樣的處理過程，求得工作曲線回歸方程。色譜條件：Waters Symmetry C18色譜柱(50×2.1 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈和0.1%甲酸溶液，流速0.2 mL/min。柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓3.0 kV，源溫度為110 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，錐孔氣流50 L/h，脫溶劑氣流650 L/h，碰撞氣體為氬氣，碰撞氣流速0.18 mL/min。電噴霧電離負(fù)離子方式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式檢測(cè)。

2.2.2 方法學(xué)考察 用乙酸乙酯提取房水和角膜片中的Amphotericin B，在質(zhì)譜檢測(cè)的過程中，提取基質(zhì)對(duì)藥物的離子化沒有明顯的抑制，效果比較滿意。本文建立的樣品預(yù)處理方法具有揮干速度快、雜質(zhì)少、提取率高而且穩(wěn)定的特點(diǎn)。色譜圖表明，本研究采用的分析方法具有較好的特異性，而且分析速度快。

2.2.3 標(biāo)本的保存、處理和檢測(cè) 房水及角膜標(biāo)本取得后，放于-80℃的低溫冰箱中冷凍保存。

3 結(jié)果

3.1 測(cè)定房水中AmB的工作曲線回歸方程

以待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測(cè)化合物的濃度為橫坐標(biāo)作圖，得工作曲線。Amphotericin B的典型工作曲線回歸方程為y=0.0462x-0.0442，γ2=0.9988，n=6，線性范圍為1.0～200 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.5 ng/mL(見圖2)。

圖2 房水樣品中AmB的工作曲線回歸方程

3.2 測(cè)定角膜片樣品中AmB的工作曲線回歸方程

以待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測(cè)化合物的濃度為橫坐標(biāo)作圖，得工作曲線。AmB的典型工作曲線回歸方程為y=0.0393x-0.0152，γ2=0.9989，n=6，線性范圍為1.0～200 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.5 ng/mL(見圖3)。

圖3 角膜片樣品中AmB的工作曲線回歸方程

3.3 房水及角膜內(nèi)藥物濃度測(cè)定

0.5% LAmB、0.25% LAmB及0.5% AmB滴眼液使用5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h及8 h角膜中的AmB濃度結(jié)果見表1，房水中的AmB濃度結(jié)果見表2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)三組兔眼角膜中的藥物濃度(μg/mL)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)三組兔眼房水中的藥物濃度(μg/mL)

4 討論

目前在我國真菌性角膜炎居感染性角膜炎的首位，占感染性角膜炎的62%，我國大陸地區(qū)主要病原體為鐮刀菌屬(64.95%)和曲霉菌屬(14.43%)[1]。多烯類是目前常用的抗真菌藥物，主要有那他霉素(natamycin，pimaricin)和兩性霉素B(AmB)。其作用機(jī)制是阻止真菌細(xì)胞膜麥角固醇合成，膜的滲透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡[2]。AmB除了能使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致重要的細(xì)胞內(nèi)容物流失而造成菌體死亡，也可通過刺激巨噬細(xì)胞調(diào)整自體免疫功能產(chǎn)生殺真菌作用，研究表明AmB對(duì)常見致病菌屬均敏感[3-4]。臨床表現(xiàn)上曲霉菌性角膜潰瘍中菌絲多呈垂直生長、斜行生長[5]易穿透角膜后彈力層引起嚴(yán)重的虹膜反應(yīng)和真菌性眼內(nèi)炎早期就會(huì)出現(xiàn)角膜組織的壞死、溶解、穿孔，病情更危重預(yù)后極差[6]，因此觀察角膜及前房內(nèi)AmB藥物濃度對(duì)其療效有重要的臨床需求。

有文獻(xiàn)報(bào)道，AmB對(duì)鐮刀菌屬、曲霉菌屬及念珠菌屬的MIC90均為4.0g/mL[7]。本研究觀察0.5% LAmB、0.25% LAmB及0.5% AmB滴眼液在角膜及房水中的藥物濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 min內(nèi)0.5% AmB與0.5%LAmB在角膜中均可達(dá)到高于MIC90的藥物濃度，而0.25%LAmB則在點(diǎn)藥1 h后達(dá)到高于MIC90的藥物濃度，三組持續(xù)時(shí)間均長達(dá)8h。0.5%LAmB、0.25%LAmB、0.5%AmB滴眼液在房水中檢測(cè)的藥物濃度高于MIC90分別在點(diǎn)藥5 min、15 min及1 h后，前兩者均可持續(xù)至點(diǎn)藥8 h，而0.5%AmB滴眼液持續(xù)至2 h即下降至MIC90以下。通過以上研究我們發(fā)現(xiàn)，0.5%LAmB、0.25%LAmB及0.5%AmB滴眼液在曲霉菌性角膜炎的治療中均能發(fā)揮有效的作用，而LAmB較AmB在房水中的藥物濃度更持久。

AmB的抗真菌活性取決于其穿透真菌細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞膜的能力，其通過與真菌細(xì)胞膜上的固醇(主要為麥角固醇)結(jié)合，造成膜通透性改變胞內(nèi)容物流出而使真菌細(xì)胞死亡；而AmB也能結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中的固醇(主要為膽固醇)，對(duì)動(dòng)物和人類腎臟造成毒性[8]。LAmB是將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊，是一種定時(shí)定向藥物載體，AmB與膽固醇結(jié)合后可進(jìn)入脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層，并保留在其中，同時(shí)脂質(zhì)體使真菌細(xì)胞壁孔隙增加，更利于AmB到達(dá)真菌的細(xì)胞膜，不僅能降低與人體細(xì)胞膜中膽固醇的結(jié)合還能增強(qiáng)對(duì)真菌細(xì)胞麥角固醇的結(jié)合，從而發(fā)揮AmB的最大殺菌能力[9]。這與研究脂質(zhì)體包埋AmB增強(qiáng)了對(duì)曲霉菌的抗菌作用結(jié)果相符[7，10]。

在臨床中，由于曲霉菌性角膜炎具有難治、病程長、易反復(fù)的特點(diǎn)[11]，因此需早期的頻繁點(diǎn)眼并持續(xù)較長時(shí)間。0.5%AmB因在眼內(nèi)的半衰期短，局部應(yīng)用刺激性大，造成患者的依從性降低，與本研究結(jié)果其在房水中的藥效維持時(shí)間較短相符。而LAmB具有眼內(nèi)半衰期長，藥物利用度高，藥效持久且局部應(yīng)用刺激性小[12-14]等特點(diǎn)。另有研究表明0.5% LAmB滴眼液對(duì)角膜內(nèi)皮的毒性要高于0.25%并且隨著作用時(shí)間的延長而加重[15-16]。依據(jù)本研究結(jié)果顯示，0.25% LAmB滴眼液使用頻次3次/24 h即可達(dá)到治療目的，不僅可減少點(diǎn)藥次數(shù)提高患者依從性，同時(shí)也可減少藥物對(duì)眼表的副作用[17]。因此0.25%LAmB滴眼液是臨床工作較安全、有效的藥物濃度[18]。

5 結(jié)論

LAmB較AmB治療曲霉菌性角膜炎更安全、有效，且0.25%LAmB具有毒性低、效果好并成本低的優(yōu)點(diǎn)，但目前尚無0.25% LAmB滴眼液的成品，本試驗(yàn)為臨床工作提供了確切的實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。但由于本試驗(yàn)研究時(shí)間較短，藥物的使用頻率是否有更合適的選擇，更長時(shí)間的藥物濃度檢測(cè)是否有變化，其他不同濃度相關(guān)的藥物動(dòng)力學(xué)等有待于更進(jìn)一步研究。