黎婷 張海燕

雌性生殖干細(xì)胞的研究進(jìn)展

黎婷 張海燕

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖，241000)

生殖干細(xì)胞在雄性生物終生的配子形成過程中發(fā)揮作用，但只在部分無脊椎雌性生物（如果蠅）和低等脊椎雌性動物（如硬骨魚和部分猿猴亞目的猴）中的配子形成過程中可見。多年來傳統(tǒng)的生殖生物學(xué)觀念認(rèn)為，雌性哺乳動物出生后卵巢中并沒有卵子發(fā)生的能力，出生時卵泡的數(shù)量和其隨后不斷減少的速率決定了雌性生殖動物的生殖壽命。然而近期研究顯示，在小鼠、大鼠等多種哺乳動物出生后的卵巢中成功分離和培養(yǎng)了雌性生殖干細(xì)胞（Femle Germline Stem Cells，F(xiàn)GSCs）。更有科研團(tuán)隊(duì)，利用FGSCs誘導(dǎo)不孕母鼠懷孕并產(chǎn)生正常后代，或者將人的FGSCs移植到小鼠后獲得了原始卵泡。如果成年女性卵巢中確實(shí)存在FGSCs，那么更年期的發(fā)生并不是因?yàn)橛邢迶?shù)目的卵子的耗盡，而是因?yàn)镕GSCs和體細(xì)胞的老化。因此，F(xiàn)GSCs在基礎(chǔ)研究和臨床治療中有巨大的研究價值和應(yīng)用前景，將為治療卵巢功能衰退、不孕不育以及延緩女性衰老發(fā)揮重要作用。

哺乳動物；雌性；生殖干細(xì)胞。

引言

干細(xì)胞是一類原始未分化、擁有多潛能性和自我復(fù)制能力的細(xì)胞，在不同的發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞和成年干細(xì)胞，成年干細(xì)胞分為軀體干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞。一般認(rèn)為，雌性脊椎動物大部分是由胚胎期的囊胚形成原始生殖細(xì)胞，通過變形運(yùn)動，逐漸經(jīng)過卵黃囊、尿囊到達(dá)生殖脊，和部分中胚層共同形成卵巢。在各信號通路的調(diào)控下，原始生殖細(xì)胞分化成卵原細(xì)胞，卵原細(xì)胞通過有絲分裂迅速增殖，并遷移到卵巢皮質(zhì)。最終卵原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，分化成初級卵母細(xì)胞。這些初級卵母細(xì)胞表面環(huán)繞了顆粒細(xì)胞后形成原始卵泡，只有一小部分原始卵泡能夠最終發(fā)育為成熟卵泡并排出[1]。

生殖干細(xì)胞特別之處在于是能夠產(chǎn)生具有生殖功能的配子細(xì)胞，早在一個世紀(jì)之前，致力于研究精子發(fā)生的Reguad就假設(shè)了在睪丸中必然有能夠保持分化的細(xì)胞，而這種細(xì)胞早就被證實(shí)為是雄性生殖干細(xì)胞，在雄性哺乳動物睪丸中能夠持續(xù)增殖、分化，從而維持精子發(fā)生，所以雄性動物的生殖年限要長于雌性動物[2]。雖然在一些非哺乳動物中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了FGSCs，但是哺乳動物中是否存在FGSCs仍存在爭議[3-4]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，雌性哺乳動物在出生時卵巢中儲備了定量的不具備增殖能力的生殖細(xì)胞，這些細(xì)胞隨著年齡增長被耗盡[5]。然而自2004年起，越來越多的研究結(jié)果與這一傳統(tǒng)生殖生物學(xué)傳統(tǒng)觀念相悖，矛盾的中心圍繞FGSCs是否存在和分離方法是否有效，這些細(xì)胞在成年哺乳動物體內(nèi)的作用的生理學(xué)作用仍然有待研究。卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟直至能夠受精是一個多方面調(diào)控的復(fù)雜過程，需要對減數(shù)分裂和正確的基因組印記進(jìn)行及時調(diào)控[6]，包括親代等位基因DNA甲基化的表觀調(diào)控等。故而今后涉及哺乳動物FGSCs體外培養(yǎng)和成熟過程中，關(guān)于調(diào)控的研究必須完整和正確才能確保臨床的可應(yīng)用性。

1. 非哺乳動物中的FGSCs

研究表明，一些動物出生后卵巢中卵子的數(shù)量確實(shí)是靠FGSCs分化補(bǔ)充，比如果蠅屬中的果蠅，能夠在果蠅屬卵巢管頭端的一個特殊生殖細(xì)胞龕里有效分離出少量原始生殖細(xì)胞（Primordial Germline Cells，PGCs）[7]。在出生后，這個生殖細(xì)胞龕就會控制FGSCs的分化和新的卵母細(xì)胞的產(chǎn)生，從而為整個繁殖期源源不斷的提供生殖細(xì)胞。在硬骨魚中的青鳉和斑馬魚的卵巢中也發(fā)現(xiàn)了這個生殖細(xì)胞龕，位于卵巢干上，而且在這個位置發(fā)現(xiàn)了具有FGSCs特性并進(jìn)行減數(shù)分裂的細(xì)胞，可以持續(xù)供給卵巢新的卵母細(xì)胞[8]。在這些魚類和果蠅的整個繁殖期，這種卵子發(fā)生的方式才能產(chǎn)生大量卵子，相對于哺乳動物嚴(yán)格的卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育過程，更類似于精子發(fā)生的過程。

2. 哺乳動物中的FGSCs

在2004年之前，普遍認(rèn)為成年哺乳動物中缺乏FGSCs，但蜂猴目中有兩個家族，原猴亞目和狐猴，被報道在卵巢皮質(zhì)“龕”中存在進(jìn)行減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞[9-10]，并且能夠經(jīng)歷卵泡發(fā)生從而產(chǎn)生成熟的卵母細(xì)胞。如果這些動物中確實(shí)鑒定出了FGSCs，那其它雌性哺乳動物中為什么不能存在FGSCs？接下來在成年小鼠閉鎖的卵泡中發(fā)現(xiàn)了這個傳說中的FGSCs[11]，說明成年小鼠有新的卵子發(fā)生來填充已經(jīng)閉鎖的卵泡，從而維持整個生殖期的需要。研究發(fā)現(xiàn)成年小鼠一天產(chǎn)生77個原始卵泡，在卵巢上皮中就發(fā)現(xiàn)了少量有絲分裂的卵圓形細(xì)胞，而且表達(dá)生殖細(xì)胞特異性蛋白MVH，甚至把一塊野生型小鼠的卵巢皮質(zhì)移植到特異性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢中，3-4周后GFP陽性的卵泡周圍就有野生型體細(xì)胞，這說明具有增殖能力的細(xì)胞就位于卵巢皮質(zhì)中，才能持續(xù)進(jìn)行卵子發(fā)生[12]。

接著Zou利用流式細(xì)胞儀，選用特異性抗體如DDX4、IFITM3等，分選了一些直徑為12-20μm的細(xì)胞，這些細(xì)胞同時表達(dá)多潛能性細(xì)胞和生殖細(xì)胞的標(biāo)記物，并具有正常的染色體組型，他們用GFP標(biāo)記了FGSCs后并將其移植到野生型小鼠卵巢，產(chǎn)生了GFP陽性后代，說明了FGSCs具有進(jìn)行卵子發(fā)生的能力[13]。越來越多的團(tuán)隊(duì)利用不同的分離技術(shù)獲得了出了FGSCs，而人類的FGSCs是在2012年由White首次分離獲得，由White及其團(tuán)隊(duì)利用熒光活化細(xì)胞分選方法分離出小鼠和人類的FGSCs，直徑為5-8μm，雖不同于Zou及其團(tuán)隊(duì)分離的FGSCs，但是表達(dá)相似的生殖細(xì)胞標(biāo)記物，這些細(xì)胞的比例非常小，小鼠卵巢中約占0.014%±0.002%[14]。這些FGSCs在體外培養(yǎng)時會產(chǎn)生卵子樣細(xì)胞，并且表達(dá)卵母細(xì)胞特異性標(biāo)記物和有絲分裂標(biāo)記物，用GFP+的FGSCs后移植到GFP-的小鼠卵巢皮質(zhì)中，會得到包圍著野生型顆粒細(xì)胞而GFP+的原始卵泡[15]。盡管利用不同的方法，分出獲得的細(xì)胞大小不一，越來越多的團(tuán)隊(duì)證實(shí)在卵巢中分離出了FGSCs細(xì)胞群。

3. FGSCs與更年期

如果卵巢在成年期確實(shí)有制造新的卵子的能力，那問題就來了：為什么女性會有更年期？因?yàn)閭鹘y(tǒng)觀念認(rèn)為當(dāng)有限的卵子耗盡，女性就進(jìn)入更年期，如果當(dāng)成年期卵子發(fā)生確實(shí)發(fā)生，新卵子的產(chǎn)生應(yīng)當(dāng)會阻止更年期的到來。目前推斷了兩個機(jī)制：FGSCs并不能產(chǎn)生卵子，或者是體環(huán)境并不支持卵子發(fā)育[16-17]?？赡蹻GSCs和其它體細(xì)胞一樣會老化，會凋亡，從而失去了再生和分化的能力。果蠅到老齡時，新卵子的產(chǎn)生也大大減少，和FGSCs分化速率減慢和卵子發(fā)育時的細(xì)胞凋亡有關(guān)[18]。也有研究證實(shí)，生殖細(xì)胞某些細(xì)胞因子的年齡依賴性退化，可能會影響FGSCs再生的能力，包括BMP蛋白、E黏蛋白等細(xì)胞因子的減少[19]。哺乳動物的老化也可能歸因于干細(xì)胞的衰老，造血、神經(jīng)和肌肉干細(xì)胞功能都隨著老化而下降[20]。Pacchiarotti發(fā)現(xiàn)隨著小鼠年齡的增長，從卵巢中可分離的FGSCs數(shù)量減少[21]。還有研究發(fā)現(xiàn)，只有把老齡小鼠FGSCs移植到年輕小鼠的卵巢中，才能進(jìn)行卵泡生成，這意味著圍繞著卵巢的細(xì)胞和微環(huán)境對于FGSCs在維持女性生殖功能中也發(fā)揮著重要作用[22]。但是由于缺乏FGSCs對于出生后卵泡形成的功能和在生理?xiàng)l件下的受孕的關(guān)鍵證明，對于FGSCs還是很有爭議，因?yàn)橐陨涎芯慷际菍?shí)驗(yàn)室條件下獲得的，和自然條件下卵巢的功能沒有任何相關(guān)性。

但是無論是基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用，F(xiàn)GSCs應(yīng)用的潛力很大，F(xiàn)GSCs可以作為研究卵子發(fā)育和成熟的模型。如Park利用成年小鼠的FGSCs研究BMP4的功能，體外培養(yǎng)FGSCs特異性添加BMP4，不僅FGSCs分化成具有卵子樣結(jié)構(gòu)細(xì)胞的比例更高，和減數(shù)分裂起始相關(guān)基因的表達(dá)也提高了[23]。Zhang利用GFP-FGSCs移植到野生型小鼠后，不僅獲得了熒光小鼠后代，還利用基因敲除技術(shù)獲得了基因缺失小鼠，從而研究基因的功能[24]。在臨床應(yīng)用中，F(xiàn)GSCs也有很大的應(yīng)用空間，但是受當(dāng)下技術(shù)條件等因素影響，但是在保留生殖可能和逆轉(zhuǎn)生殖衰老等方面都有可能發(fā)揮巨大的作用。當(dāng)患有癌癥的女性需要進(jìn)行化療或者放療前，可以提前保留一塊卵巢皮質(zhì)，把FGSCs分離出來，在需要時進(jìn)行試管受精，或者體內(nèi)移植而自然受孕。

4. 展望

卵巢是女性重要的內(nèi)分泌和生殖器官，不僅可以分泌雌、孕激素，維持女性特征和心理健康，還可以產(chǎn)生卵子，賦予女性生育能力。FGSCs的報道激發(fā)了更多生殖學(xué)專家的研究興趣，因?yàn)樵絹碓蕉嗟难芯匡@示了FGSCs在體外分離培養(yǎng)以及卵子發(fā)生的能力。盡管FGSCs的生理學(xué)功能還沒揭示，關(guān)于體外培養(yǎng)時卵子發(fā)生也備受質(zhì)疑，但是FGSCs的應(yīng)用前景十分巨大，研究卵子發(fā)育和臨床應(yīng)用的意義在于提出了新的非激素治療方法的可能，以期更加安全有效的修復(fù)卵巢損傷和重建卵巢功能，減緩卵巢衰老，也可以作為種子細(xì)胞，在優(yōu)良品種的開發(fā)和瀕危動物的保種中發(fā)揮作用，具有極大的臨床應(yīng)用價值。

[1] Pan Z, Sun M, Liang X, et al. The Controversy, Challenges, and Potential Benefits of Putative Female Germline Stem Cells Research in Mammals[J]. Stem Cells International,2016,(2015-12-15), 2015, 2016(12):1-9.

[2] Regaud C:[Studies on the structure of seminiferous tubules and on spermatogenesis in mammals]. Part 1.Archives d’Anatomie microscopiques et de Morphologie experimentale 1901,4:101–156

[3] MacDonald JA, Takai Y, Ishihara O, Seki H, Woods DC, Tilly JL. Extracellular matrix signaling activates differentiation of adult ovary-derived oogonial stem cells in a species-specific manner. Fertil Steril[J]. 2019 Apr; 111(4):794-805.

[4] Spradling A, Fuller M T, Braun R E, et al. Germline stem cells.[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology[J], 2011, 3(11):a002642.

[5] Allen E. Ovogenesis during sexual maturity[J]. Developmental Dynamics[J], 1923, 31(5):439–481.

[6] Martin JJ, Woods DC2, Tilly JL.Implications and Current Limitations of Oogenesis from Female Germline or Oogonial Stem Cells in Adult Mammalian Ovaries[J].Cells. 2019 Jan 28;8(2).

[7] Xie T, Spradling A C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary[J]. Science, 2000, 290(5490):328-30.

[8] Nakamura S, Kobayashi K, Nishimura T, et al. Identification of germline stem cells in the ovary of the teleost medaka[J]. Science, 2010, 328(5985):1561-3.

[9] Gallicano GI.Germ-line stem cells in myocardial regeneration: Secretion of cardiogenic paracrine effectors may be the future. J Stem Cells Regen Med. 2018 Dec 30;14(2):87. eCollection 2018.

[10] Telfer EE1, Anderson RA. The existence and potential of germline stem cells in the adult mammalian ovary[J]. Climacteric. 2019 Feb;22(1):22-26.

[11] Johnson J, Canning J, Kaneko T, et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary[J]. Nature, 2004, 428(6979):145-150.

[12] Faddy M J, Telfer E, Gosden R G. The kinetics of pre-antral follicle development in ovaries of CBA/Ca mice during the first 14 weeks of life[J]. Cell Proliferation, 2010, 20(6):551-560.

[13] Zou K, Yuan Z, Yang Z, et al. Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries.[J]. Nature Cell Biology, 2009, 11(5):631.

[14] White Y A, Woods D C, Takai Y, et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women.[J]. Nature Medicine, 2012, 18(3):413-421.

[15] Pacchiarotti J, Ramos M T, Marh J, et al. Differentiation potential of germ line stem cells derived from the postnatal mouse ovary[J]. Differentiation, 2010, 79(3):159-170.

[16] 趙柯杰. 淫羊藿多糖對卵泡細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)理研究[J]. 安徽科技學(xué)院學(xué)報, 2017(3):6-10.

[17]王少兵,龐訓(xùn)勝,陶顯娣,等. 小鼠卵巢中Frizzled家族基因的表達(dá)研究[J]. 安徽科技學(xué)院學(xué)報, 2013, 27(1): 6-11.

[18] Zhao R, Xuan Y, Li X, et al. Age-related changes of germline stem cell activity, niche signaling activity and egg production in Drosophila[J]. Aging Cell, 2008, 7(3):344-354.

[19] Pan L, Chen S, Weng C, et al. Stem cell aging is controlled both intrinsically and extrinsically in the Drosophila ovary[J]. Cell Stem Cell, 2007, 1(4):458-469.

[20] Signer R A, Morrison S J. Mechanisms that Regulate Stem Cell Aging and Life Span[J]. Cell Stem Cell, 2013, 12 (2):152-165.

[21] Zou K, Hou L, Sun K, et al. Improved Efficiency of Female Germline Stem Cell Purification Using Fragilis-Based Magnetic Bead Sorting[J]. Stem Cells & Development, 2011, 20(12):2197-204.

[22] Yuichi N, Teruko N, Tilly J L. Aged mouse ovaries possess rare premeiotic germ cells that can generate oocytes following transplantation into a young host environment[J]. Aging, 2009, 1(12):971-978.

[23] Park E S, Woods D C, Tilly J L. Bone morphogenetic protein 4 (BMP4) promotes mammalian oogonial stem cell differentiation via Smad1/5/8 signaling[J]. Fertility & Sterility, 2013, 100(5):1468-1475.e2.

[24] Zhang Y, Yang Z, Yang Y, et al. Production of transgenic mice by random recombination of targeted genes in female germline stem cells[J]. Journal of Molecular Cell Biology, 2011, 3(2):132-141.

Progress of Research on Female Germline Stem

LI Ting & ZHANG Hai-yan

Germline stem cells (GSCs) play a role in gametogenesis in males, but only seen in gametogenesis of some female invertebrates and lower vertebrates. The conventional viewpoint is that female mammals have no ability of generate new germ cells in their ovaries after birth, and their productive life span depends on the number of follicles and their subsequent decreasing rate. However, recent studies show that researchers have successfully isolated and cultured a type of germ cell from postnatal ovaries in a variety of mammalian species. Even some research teams have made infertile mice pregnant induced by female germline stem cells (FGSCs) and obtained normal offspring, or obtain original follicles by transplanting human FGSCs into the bodies of mice. If there are FGSCs literally in the ovaries of adult females, the occurrence of menopause is caused by aging of FGSCs and somatic cells instead of by the exhaustion of limited supply of eggs. Therefore, FGSCs are of great researching values to and have application prospects in basic research and clinical treatment, and will play an important role in treatment for ovarian failure and infertility as well as female anti-aging.

mammal; female; germline stem cells.

Q813

A

1009-1114（2019）02-0027-03

2019-04-09

黎婷（1984—），女，安徽蕪湖人，博士研究生，講師，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因分子育種和去細(xì)胞生物工程材料。

研究項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2018A0691）；蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級人才項(xiàng)目（wzyrc201801）

文稿責(zé)編 湯強(qiáng)