程卓鑫 劉 淘 王國才 曲義坤 徐 劍 劉偉新 焦成斌

佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普通外科，黑龍江省佳木斯市 154002

PKIB是一種新的耐熱蛋白,它由78個氨基酸殘基組成是PKI家族的成員，研究顯示PKIB基因與乳腺癌、前列腺癌及肺癌等眾多腫瘤的發(fā)展密切相關[1-2]，尤其是PKIB在乳腺癌細胞增殖中起重要作用[1]。而PKIB表達對胰腺癌細胞生物學行為影響的相關研究較少。筆者通過觀察PKIB表達程度的改變對胰腺癌細胞的增殖和侵襲影響，探討其與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑 人胰腺癌細胞的細胞株PANC-1、正常胰腺導管上皮細胞購自中國科學院細胞庫。β-肌動蛋白抗體購于美國加州圣克魯斯生物技術公司。PKIB 抗體購于美國 Abcam (Cambridge, MA, USA)。其余實驗所用材料均來自佳木斯大學實驗室。

1.2 細胞培養(yǎng) 正常胰腺導管上皮細胞,人胰腺癌細胞株PANC-1培養(yǎng)在37℃、1640培養(yǎng)液加入10%的胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、空氣95%、二氧化碳5%的培養(yǎng)箱中。

1.3 shRNA-PKIB和PKIB過表達基因的構建和轉染 shRNA-PKIB和PKIB過表達基因由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。PANC-1細胞(4×105)接種于6孔板，無雙抗RPMI 1640孵育24h，使細胞鋪板面積至30%～50%，每孔加入LipofectamineTM2000 5μl及shRNA和PKIB過表達基因100pmol分別充分混勻后，于無血清及雙抗的培養(yǎng)液中轉染，37℃孵育6h后更換新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液， 恒溫常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h后，并按設計進行分組實驗。

1.4 Western blot檢測PKIB蛋白表達 將經(jīng)過不同處理的細胞以5×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)48h后經(jīng)過均勻加工和RIPS緩沖器超聲處理。在4℃12 000g離心10min移除雜質。取50μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，然后移至聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜。3%牛血清白蛋白(BSA)固定薄膜，加入一抗，接著PBST洗膜后加入二抗。加入硝基藍四氮唑后顯影。β-actin作為內參照。

1.5 RT-PCR檢測PKIB的mRNA表達水平 應用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)。引物由Applied Biosystems Primer Express 3.0特定設計。特定引物用BLAST 程序固定。每20μl反應包含 1x SYBR? Premix Ex Taq TM II,10μM正向和反向引物、0.4μl ROX reference染料、cDNA 2μl。ABI 7300 測序儀反應條件：95℃30s、95℃5s共40個周期、60℃30s。靶基因表達的相關定量(RQ)由2-ΔΔCT方法計算。RQ分析的第一步是檢測標準β-肌動蛋白(ΔCt)靶基因表達水平。第二步是比較不同樣本中標準靶基因表達的不同。每個樣品的PCR反應重復3次。

1.6 MTT比色法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期PANC-1細胞以5×103個/孔接種于96孔板。該細胞培養(yǎng)24h后分別做不同處理后標記為shRNA-PKIB細胞組、PKIB過表達細胞組和空轉載體對照組，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)72h后各孔加入5g/L MTT 20μl,繼續(xù)置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，后各孔加入標準濃度二甲基亞砜(DMSO)200μl，震蕩混勻15min，用酶標儀于540nm波長條件下測定吸光度值。實驗重復3次。

1.7 結晶紫實驗檢測細胞存活率 不同的細胞分組以5×103個/孔被種植在6孔板，放置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7d，2～3d換1次培養(yǎng)基。然后用預先保溫磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，之后保留的細胞用結晶紫溶液染色2h(0.5%結晶紫，20%甲醇)。將培養(yǎng)皿反復洗滌3次，除去結晶紫溶液。待培養(yǎng)皿在37℃下干燥后用照相機采取樣本圖片。

1.8 Transwell侵襲小室實驗 于Transwell小室中加入60μg Matrigel膠(用2倍體積的無血清RPMI 1640稀釋)，37℃、30min待膠凝固，在小室下部分為含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的細胞(5×104個)常規(guī)培養(yǎng)24h，取出小室，PBS洗滌，用棉簽小心擦去微孔膜內層的細胞，95%酒精固定，結晶紫染色。每張膜計數(shù)5個100倍顯微鏡視野下的穿膜細胞數(shù)，照相并計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法 定性數(shù)據(jù),包括蛋白免疫印跡和細胞圖像等，每組至少重復3次。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±SD表示，統(tǒng)計兩組之間的差異以雙尾非配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在胰腺癌細胞中PKIB的表達上調 為確定PKIB表達與胰腺癌的相關性，首先應用Western blot檢測胰腺癌細胞和正常胰腺導管上皮細胞中PKIB的表達。結果胰腺癌細胞與正常胰腺導管上皮細胞相比較PKIB的表達明顯上調(圖1-1和圖1-2)[PKIB：(0.15±0.03)VS(0.30±0.06),t=9.87,P<0.001]。由此說明PKIB可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關性。

圖1-1 Western blot試驗檢測正常胰腺導管上皮細胞與PANC-1細胞PKIB蛋白的表達情況

圖1-2 正常胰腺導管上皮細胞與PANC-1細胞PKIB蛋白相對表達量

2.2 PKIB過表達促進PANC-1細胞增殖 PKIB過表達基因轉染PANC-1后，應用RT-PCR與Western blot檢測PKIB mRNA與蛋白的表達情況，結果表明PKIB mRNA表達增多(圖2-1)[mRNA：(1.00±0.30)VS(2.20±0.51),t=9.23,P<0.001]，同時蛋白表達增多(圖2-2和圖2-3)[PKIB:(0.30±0.09)VS(0.59±0.11),t=9.73,P<0.001]。然后應用MTT檢測PKIB過表達對PANC-1存活能力的影響，結果表明PKIB過表達PANC-1的存活能力增強(圖2-4)[存活：(1±0.29)VS(1.7±0.34),t=7.22,P<0.001]。應用結晶紫實驗檢測PANC-1的增殖能力，結果表明PKIB過表達增強胰腺癌的增殖能力(圖 2-5)。以上結果顯示PKIB的過表達可促進胰腺癌細胞的增殖，并提高其生存能力。

圖2-1 RT-PCR檢測對照組與實驗組mRNA表達情況

圖2-2 Western blot試驗檢測對照組與實驗組蛋白的表達情況

圖2-3 對照組與實驗駔PKIB蛋白相對表達量

圖2-4 MTT試驗檢測對照組與實驗組細胞間的相對活力

圖2-5 結晶紫試驗檢測細胞增殖能力

2.3 沉默PKIB表達可抑制PANC-1細胞增殖 shRNA-PKIB轉染PANC-1后沉默PKIB的表達PKIB mRNA(圖3-1)[mRNA：(1.00±0.26)VS(0.30±0.08),t=11.67,P<0.001]與蛋白表達量明顯減少(圖3-2 和圖3-3)[PKIB：(0.28±0.05)VS(0.06±0.01),t=9.23,P<0.001]。應用MTT檢測PKIB表達減少對PANC-1存活能力的影響，結果表明沉默PKIB表達降低PANC-1的存活能力(圖3-4)[存活：(1.00±0.39)VS(0.53±0.20),t=4.85,P<0.001]。應用結晶紫實驗檢測PANC-1的增殖能力，結果表明沉默PKIB表達抑制PANC-1的增殖(圖3-5)。由此說明沉默PKIB表達可抑制PANC-1細胞增殖，降低其存活能力。

圖3-1 RT-PCR檢測對照組與實驗組mRNA表達情況

圖3-2 Western blot試驗檢測對照組與實驗組蛋白的表達情況

圖3-3對照組與實驗組PKIB蛋白相對表達量

圖3-4 MTT試驗檢測對照組與實驗組細胞間的相對活力

圖3-5 結晶紫試驗檢測細胞增殖能力

2.4 PKIB表達程度影響PANC-1侵襲能力 胰腺癌細胞的侵襲是導致胰腺癌患者死亡的主要原因。通過檢測PKIB的表達程度來說明其對胰腺癌細胞侵襲能力的影響。結果表明PKIB過表達增強PANC-1侵襲能力(圖4-1和圖4-2)[侵襲：(1.00±0.32)VS(2.70±0.39),t=15.64,P<0.001]，沉默PKIB表達后PANC-1的侵襲數(shù)明顯減少(圖4-3和圖4-4)[侵襲：(1.00±0.26)VS(0.40±0.14),t=9.23,P<0.001]。由此可說明PKIB在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到關鍵作用。

圖4-1 Transwell侵襲試驗

圖4-2 對照組與實驗組侵襲細胞相對數(shù)

圖4-3 Transwell侵襲試驗

圖4-4 對照組與實驗組侵襲細胞相對數(shù)

3 討論

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前5年生存率不足5%[3]。胰腺癌臨床發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，臨床上的確定診斷病例大多為晚期，大部分患者就診時已失去手術機會，而進展期胰腺癌的治療由于其惡性度高，對化療藥物有耐藥性，當前尚缺乏理想的化療藥物。胰腺癌患者的低生存率和對化療藥物的敏感性差是目前胰腺癌治療中面臨的最大困難，然而靶向分子治療已成為胰腺癌治療的新熱點。PKIB是一種新的耐熱蛋白,它由78個氨基酸殘基組成是PKI家族的成員，PKI包括3個不同的亞型:PKIα、PKIβ、PKIγ,每個亞型在腦中均有表達。PKIβ最初是從兔睪丸分離得到,在人和大鼠組織中也被證實[5]。已有研究表明PKIB基因與眾多腫瘤的生物學行為密切相關。PKIB的表達對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，并且與Akt存在密切的關聯(lián)[1]。PKIB過表達可增強前列腺癌的侵襲能力，同樣與Akt關系密切[2]。而先前大量的實驗研究表明Akt的異常表達與激活可調控胰腺癌細胞的生長和凋亡，影響胰腺癌細胞的生存能力，并對胰腺癌細胞的侵襲能力起重要作用[6]。PI3K/Akt信號通路廣泛參與細胞增殖、生存、抗凋亡，59%的胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)存在PI3K/Akt信號通路[7]，本實驗就此探究PKIB表達對胰腺癌增殖與侵襲的影響。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞和正常胰腺導管上皮細胞相比PKIB的表達明顯上調。而且PKIB表達程度與胰腺癌細胞的增殖和侵襲密切相關。由此可說明PKIB極可能作為一種致癌基因調控胰腺癌的增殖和侵襲。

腫瘤細胞的無限增殖及轉移是腫瘤發(fā)生并導致患者死亡的重要原因，而腫瘤細胞增殖能力的提升和其凋亡的抑制直接導致了腫瘤細胞的過度增長。以此為出發(fā)點可為腫瘤的分子靶向治療提供一個新的靶點。本實驗研究顯示PKIB的表達程度與胰腺癌的生物學行為息息相關。PKIB過表達促進PANC-1細胞的增殖，而沉默其表達可抑制PANC-1細胞增殖。由此可說明PKIB參與胰腺癌細胞的增殖并且起促進作用。導致癌癥患者死亡的另一重要的原因為腫瘤細胞的侵襲和轉移。本實驗證明了PKIB表達對胰腺癌細胞的侵襲起重要作用。結果表明PKIB過表達增強PANC-1侵襲能力，而沉默PKIB表達抑制PANC-1侵襲能力。以上結果雖然可證明PKIB作為原癌基因參與調節(jié)胰腺癌細胞的增殖，但其作用機制和相關信號轉導通路的確定還需進一步的研究。此外，本實驗是在體外細胞系進行，PKIB對發(fā)病的影響還應在動物實驗行更深一步研究。

綜上所述，PKIB的表達是胰腺癌細胞增殖和侵襲的關鍵調節(jié)器，影響了胰腺癌細胞的生物學行為。調節(jié)PKIB的表達或許是胰腺癌治療的一種新策略，為胰腺癌的治療提供了新的、潛在的治療靶點。