金鑫 張志亮 陸毅 黃一雄 范志宏 陳蕊

各種原因造成的大面積骨缺損及難治性骨損傷的修復是臨床的一大難題。目前常見的治療方法都有各自的局限性，而再生醫(yī)學和組織工程技術的發(fā)展為修復骨缺損提供了新的思路。

組織工程常用的成體干細胞有BMSCs 和ADSCs。BMSCs 成骨能力良好，是骨組織工程最佳的種子細胞來源。但因其取材困難、過程痛苦、細胞含量少等原因限制了其更廣泛的應用。ADSCs 來源廣泛、細胞量多、易獲取、培養(yǎng)簡單且擴增能力強等[1]，成為骨組織工程種子細胞的研究熱點。但相比于BMSCs，其成骨能力不足[2]。因此，利用ADSCs 的既有優(yōu)勢，提高其成骨能力是亟待研究和解決的問題。

本研究將SD 大鼠的ADSCs 及BMSCs 以Transwell 共培養(yǎng)，觀察BMSCs 對ADSCs 成骨分化的影響，探討提高ADSCs 成骨活性的可能途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

實驗中ADSCs 及BMSCs 取自6 周齡雄性SD大鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin、Osteocyte Differentiation Basal Medium（Gibco，美國），L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽AA2P、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、茜素紅、膠原酶（Sigma，美國），氯化十六烷基吡啶（上海德茂化工有限公司）。

光學顯微鏡、倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本），Infinite M2000 PRO 酶標儀（Tecan，瑞士），細胞培養(yǎng)箱（ThermaoFisher Scientific，美國）。

1.2 ADSCs 及BMSCs 的分離及培養(yǎng)

6 周齡雄性SD 大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下75%乙醇浸泡1 min 后取出附睪脂肪墊，將脂肪組織盡量剪碎，放入含有等體積、預熱PBS 緩沖液的15 mL 離心管中，震蕩45 sec，靜置分層，吸除下層液體。重復上述兩步驟，直至下層變澄清。加入膠原酶溶液，37 ℃水浴震蕩，直至組織懸液混勻（50 min）。渦旋15 sec，徹底混勻細胞，離心（1 200 r/min，5 min）后小心吸除上清液，加入完全培養(yǎng)基后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h 后換液，去除未貼壁ADSCs細胞，以后每3 天換液一次。

取大鼠股骨和脛骨置于無菌的培養(yǎng)皿上方，依次用3～5 mL PBS 和無血清培養(yǎng)基沖洗2～3 次后移入另一無菌培養(yǎng)皿中。顯露骨髓腔后用1 mL 注射器吸取培養(yǎng)基，從股骨一端插入，從上至下緩慢沖洗骨髓腔，用下方的無菌培養(yǎng)皿收集骨髓懸液，重復此過程2～3 次。在15 mL 離心管中加入3 mL 培養(yǎng)基，再用吸管沿管壁緩緩加入骨髓懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，并輕輕吹散細胞10～20 次制成細胞懸液，接種到10 mm 培養(yǎng)皿中，放入CO2培養(yǎng)箱中。3 d 后換液，去除未貼壁BMSCs 細胞。以后每3 天換液一次。

7～10 d 后，待兩種細胞生長至80%～90%時，0.25%胰酶消化傳代，按1×104cells/cm2密度接種于新的培養(yǎng)瓶中。本實驗使用第2 代BMSCs 及ADSCs（經三系分化誘導及流式細胞檢測證實具有相應間充質干細胞特性）。

1.3 ADSCs 及BMSCs 以Transwell 共培養(yǎng)

1.3.1 實驗分組

第一組：單純ADSCs 組；第二組：共培養(yǎng)組（ADSCs:BMSCs=1:1），上室為BMSCs，下室為ADSCs；第三組：單純BMSCs 組。

取第2 代ADSCs 及BMSCs 進行共培養(yǎng)實驗。0.25%胰酶消化，離心后細胞計數。重懸兩種細胞至密度為1×105cells/mL。各組細胞按照分組比例加入Transwell 皿中，第一組1 mL 單純ADSCs 懸液；第二組1 mL ADSCs+1 mL BMSCs；第三組1 mL 單純BMSCs 懸液。各孔加入完全細胞培養(yǎng)基。24 h 后更換成骨誘導液。每隔3～4 天換液1 次，21 d 后進行相關染色及檢測。

1.3.2 茜素紅染色及半定量檢測

PBS 清洗細胞表面2 遍，10%甲醛固定1 h。用新鮮配制的40 mM（pH 4.2）的茜素紅染液室溫孵育10 min，dH2O 清洗5 遍，PBS 孵育15 min，晾干，光鏡下觀察并拍照。

茜素紅染色后，PBS 洗3 遍。棄上清，加入氯化十六烷基吡啶置于室溫下30 min。吸取上清，置入96 孔板，每孔100 μL。使用酶標儀，波長562 nm 處測樣本吸光值A。用氯化十六烷基溶液調零，并同時測定一組未加誘導液的單純細胞的茜素紅染色吸光值A。每個樣本重復3 次，計算平均值及標準差。其中，樣本測定值A=樣本吸光值A-單純細胞組吸光值A。將各組測得值以ADSCs 作為基準進行歸一化。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩種細胞的分離培養(yǎng)及Transwell 共培養(yǎng)

原代ADSCs 在24 h 后貼附于培養(yǎng)皿表面，并開始沿培養(yǎng)皿底面伸展。培養(yǎng)至第2 代后，可見細胞與培養(yǎng)皿接觸面積增大，由不規(guī)則狀變?yōu)榈湫偷拈L梭形。原代BMSCs 克隆樣散在分布，以圓形貼壁細胞為主。傳至第2 代，細胞形態(tài)均一，螺旋狀生長。將兩種第2 代細胞以Transwell 共培養(yǎng)，ADSCs 位于下層小室中，BMSCs 位于上層小室內。

2.2 茜素紅定性及半定量染色

茜素紅染色顯示，ADSCs 與BMSCs 以Transwell共培養(yǎng)后出現了成骨效能的變化，茜素紅染色陽性的鈣鹽沉積明顯增多。茜素紅半定量統(tǒng)計結果顯示，共培養(yǎng)組結果與ADSCs 組相比，差別顯著（P＜0.05），表明BMSCs 與ADSCs 共培養(yǎng)后能夠通過旁分泌的方式產生相關生化信號，刺激ADSCs 的成骨分化。而共培養(yǎng)組與BMSCs 組相比無統(tǒng)計學差異，表明混合培養(yǎng)后的成骨效能與單純BMSCs 組相當（圖1）。

圖2 各組茜素紅染色及半定量檢測Fig.2 Alizarin Staining and relative ARS level of each group

3 討論

ADSCs 是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，由于其增殖能力強、取材容易、在體外培養(yǎng)中易定向分化為成骨細胞等優(yōu)勢，成為骨組織工程的種子細胞之一。Lendeckel 等[3]嘗試使用自體ADSCs 來治療1 例顱骨嚴重缺損的患者。動物實驗證實，將ADSCs 植入小鼠顱骨缺損部位，12 周后能夠完全形成骨化橋接。相較于其他來源干細胞，ADSCs 具有更強的增殖、成血管能力以及遷移和歸巢的能力，但其成骨能力相較于BMSCs 還顯不足[4]。以自體ADSCs 為種子細胞的顱骨修復的結果表明，由于其骨化不全等并發(fā)癥，修復效果不能令人滿意[5]。單純用ADSCs 為種子細胞修復承重骨的研究更為少見。因此，提高ADSCs 的成骨效能是當前研究的熱點。

目前，提高ADSCs 成骨分化能力的方法主要有外源性因子調控[6]、基因工程調控[7]和物理調控[8]。共培養(yǎng)即屬于加入外源性因子的方法。共培養(yǎng)技術能夠更好地模擬細胞在體內的生長環(huán)境和細胞的性狀，利用一種輔助細胞去誘導目的細胞的分化、增殖及細胞活性的維持，進一步探究其中的機制。與體內研究相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)體積小、參數可控、結果直觀，更有利于研究細胞與細胞間，以及細胞與微環(huán)境間的相互作用。

Transwell 間接共培養(yǎng)，也叫分層滲透培養(yǎng)。主要用于研究細胞間的相互調節(jié)作用。兩種細胞在同一培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)，但由一層多孔膜相隔，使得兩種細胞間只存在彌散因子的移動交換而沒有直接接觸。本實驗中，ADSCs 與BMSCs 以Transwell 共培養(yǎng)，排除了BMSCs 對ADSCs 細胞直接接觸的影響。茜素紅及半定量染色結果表明，ADSCs 與BMSCs 共培養(yǎng)后，鈣鹽沉積量顯著提高，成骨礦化能力增強。表明BMSCs 可通過旁分泌相關細胞因子來提高ADSCs 的成骨分化能力，為ADSCs 成骨分化提供良好的微環(huán)境。

間充質干細胞的成骨分化受到多種信號通路的調控。目前主要研究的MSCs 成骨相關信號通路包括TGF-β 信號通路、MAPK 通路、JNK 通路、PI-3K通路、Notch 通路、Wnt 信號通路等。間充質干細胞的成骨分化有許多信號通路參與，或許還存在沒有發(fā)現的信號通路，大多數信號通路的確切機制并不明了，有關各通路之間相互聯系的研究較少。因此，進一步研究信號通路任重道遠。在Transwell 共培養(yǎng)體系中，BMSCs 旁分泌作用的細節(jié)仍未闡明，尚待進一步的實驗研究。