高婉茹，李跑，黃昭，覃思，曹亞男，劉霞

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

四環(huán)素類抗生素（tetracyclines，TCs）具有廣譜抗菌活性，因其價(jià)格低廉、抗菌力強(qiáng)，常作為飼料添加劑及預(yù)防、治療感染性疾病使用[1-2]。但是，若不遵守藥物的休藥期、超量使用四環(huán)素類藥物等，必然導(dǎo)致其在水體、土壤及動(dòng)物源性食品中的殘留，進(jìn)而對環(huán)境和人體健康造成極大危害[3-5]，因此，監(jiān)控動(dòng)物源性食品中的TCs 殘留是食品安全的重點(diǎn)之一，且檢測方法是其重要的技術(shù)支撐。

食品因其組成基質(zhì)復(fù)雜，且TCs 殘留量低，分析檢測前一般需要對食品中的TCs 進(jìn)行富集分離，以消除基質(zhì)干擾，提高分析檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度。傳統(tǒng)的待測物富集分離方法有液液萃取、固相萃取、基質(zhì)輔助固相分散萃取等[6]，這些方法雖有其優(yōu)點(diǎn)，但也各有缺點(diǎn)，如操作相對繁瑣、處理時(shí)間長，污染環(huán)境，分離難等問題[7-9]。因此，如何快速、準(zhǔn)確的將樣品中殘留的TCs 富集分離，是其高精準(zhǔn)檢測的關(guān)鍵所在。

近年來，F(xiàn)e3O4納米粒子（Fe3O4nanoparticles，F(xiàn)e3O4NPs）由于毒性低、價(jià)廉易得、比表面積大、形態(tài)大小可控、穩(wěn)定性好，且通過外加磁場便能簡單快速的分離待測物，已廣泛被應(yīng)用作為富集分離的載體[10-12]。分子印跡技術(shù)是從仿生的角度，用人工的方法制備出對某一特定分子具有選擇性和親和性的高分子化合物技術(shù)，通過該技術(shù)制備的高分子材料被稱為分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）[13-14]。當(dāng)模板分子被去除后，由于其具有與模板分子形狀、大小及官能團(tuán)完全匹配的印跡孔穴，能夠選擇性的識別模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物[15-17]。MIPs 具有制備簡單、成本低、物理和化學(xué)穩(wěn)定性好和可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[18]，在低濃度或復(fù)雜基質(zhì)中也能高選擇性地富集目標(biāo)物。將具有獨(dú)特磁性能的Fe3O4NPs 與特異性識別的MIPs 相結(jié)合，便可在外加磁場作用下實(shí)現(xiàn)定向移動(dòng)，直接選擇性的富集分離目標(biāo)物[19]。與傳統(tǒng)的分子印跡材料相比，省去了離心、過濾等過程，達(dá)到了簡便快速分離的目的，使得樣品前處理更加快速高效[20-22]。本研究以化學(xué)共沉淀法制備了表面羧基功能化的Fe3O4NPs，并以此作為磁性載體，以四環(huán)素為模板分子，制備出四環(huán)素磁性分子印跡納米粒子（magnetic molecularly imprinted polymers nanoparticles，MMIPs NPs）。利用該MMIPs NPs 對四環(huán)素進(jìn)行富集分離，獲得吸附性能最優(yōu)的MMIPs NPs 的制備條件和吸附條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、氫氧化鈉、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、無水乙醇、甲醇和乙酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四環(huán)素（tetracycline，TC）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；甲基丙烯酸（α-methylacrylic acid，MAA）、偶氮二異丁腈（2，2-azobisisobutyronitrile，AIBN）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2450）：日本島津公司；多功能酶標(biāo)儀（Multiskan GO）：美國Thermo Scientific 公司；超聲波清洗儀（KQ-100）：昆山市超聲儀器有限公司；旋渦振蕩儀（VORTEX-2）：美國Scientific Industries 公司；真空干燥箱（DZF-6030A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基化Fe3O4NPs 的制備

采用化學(xué)共沉淀法一步制備表面羧基化的Fe3O4NPs，即18.5 mmol FeCl3·6H2O 溶解于100 mL 去離子水中，之后轉(zhuǎn)移至250 mL 四口燒瓶中，通氮除氧并進(jìn)行機(jī)械攪拌，然后加入10 mmol FeCl2·4H2O，升溫至80 ℃。一次性加入40 mL 的NaOH 溶液（2 mol/L），溶液由棕黃色變黑后，加入1.2 g 檸檬酸，在550 r/min 下攪拌反應(yīng)1 h。待反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物借助外加磁場進(jìn)行分離，用去離子水反復(fù)洗滌至中性，并于50 ℃條件下真空干燥，作為后續(xù)制備MMIPs NPs 的載體。

1.3.2 MMIPs NPs 制備條件的優(yōu)化

1.3.2.1 TC 檢測波長的確定

分別對制備過程中所用到的模板分子TC、功能單體MAA、交聯(lián)劑EGDMA 以及引發(fā)劑AIBN，用紫外-可見分光光度計(jì)掃描紫外全波段光譜，確定TC 的最佳檢測波長。

1.3.2.2 MMIPs NPs 的制備方法

將模板分子TC 及功能單體MAA 加入到10 mL去離子水和乙醇的混合溶液（9 ∶1，體積比）中攪拌30 min，以制備預(yù)組裝溶液。取制備好的羧基化Fe3O4NPs，20 mmol 的交聯(lián)劑EGDMA，加至由TC 與MAA組成的預(yù)組裝溶液中，超聲處理30 min，以制備預(yù)聚合溶液。將制得的預(yù)聚合溶液加入到含有0.4 g PVP 的100 mL 乙醇溶液中，通氮除氧，并在300 r/min 條件下攪拌，同時(shí)升溫至60 ℃，然后加入0.1 g 引發(fā)劑AIBN，反應(yīng)時(shí)間為24 h。反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場對聚合物進(jìn)行分離，用甲醇-乙酸混合溶液洗滌數(shù)次，直至在最佳檢測波長處檢測不到洗脫液中的TC，再用甲醇和去離子水將聚合物洗滌至中性，并于50 ℃條件下真空干燥。

1.3.2.3 模板分子TC 洗脫液的確定

根據(jù)1.3.2.2 的制備方法，分別采用體積比為9 ∶1和8 ∶2 甲醇-乙酸混合溶液，超聲洗滌MMIPs NPs 數(shù)次以去除模板分子TC。依據(jù)最佳檢測波長處的吸光度值考察其洗脫效果，確定洗脫液的最優(yōu)比例。

1.3.2.4 MMIPs NPs 對TC 的吸附試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取4 mg MMIPs NPs 至5 mL 離心管中，向其中加入2 mL 0.08 mg/mL 的TC 溶液，25 ℃恒溫振蕩12 h，經(jīng)磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定其吸光度值，每個(gè)樣本平行3 次。根據(jù)MMIPs NPs 對TC 的吸附容量Q、吸附效率及分配系數(shù)K，確定制備MMIPs NPs 的最佳條件，其計(jì)算公式如下所示[23-24]：

式中：C0為TC 的初始濃度，mg/mL；Cs為上清液中TC 的濃度，mg/mL；V 為溶液的體積，mL；m 為MMIPs NPs 的質(zhì)量，g；Cp為TC 與MMIPs NPs 的結(jié)合量。

1.3.2.5 TC 與MAA 比例的確定

根據(jù)1.3.2.2 的制備方法，固定羧基化Fe3O4NPs的添加量，TC、EGDMA 的比例，在相同的合成條件下，改變TC 與MAA 的添加比例（摩爾比1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶10），確定TC 與MAA 的最優(yōu)比例。

1.3.2.6 羧基化Fe3O4NPs 添加量的確定

根據(jù)1.3.2.2 的制備方法，固定TC、MAA、EGDMA的比例，在相同合成條件下，改變羧基化Fe3O4NPs 的添加量（0.25、0.5、0.75、1.0 g），確定羧基化Fe3O4NPs的最適合添加量。

1.3.3 MMIPs NPs 富集分離TC

1.3.3.1 MMIPs NPs 添加量對吸附效率的影響

分別準(zhǔn)確稱取最優(yōu)條件下制備的MMIPs NPs 2、4、6、8、10、12、15 mg 至5 mL 離心管中，每管各加入2 mL 0.08 mg/mL 的TC 溶液，25 ℃恒溫振蕩12 h，經(jīng)磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定吸光度值，每個(gè)樣本平行3 次。根據(jù)TC 濃度的前后變化，計(jì)算其吸附效率，考察MMIPs NPs 添加量對TC吸附效率的影響。

1.3.3.2 反應(yīng)時(shí)間對吸附效率的影響

準(zhǔn)確稱取1.3.2.2 制備的MMIPs NPs 10 mg 至5 mL離心管中，每管各加入2 mL 0.08 mg/mL 的TC 溶液，25 ℃分別振蕩10、20、30、40、50、60 min，經(jīng)磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定吸光度值，每個(gè)樣本平行3 次。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出吸附后上清液的濃度，根據(jù)TC 濃度的前后變化，計(jì)算其吸附效率，考察反應(yīng)時(shí)間對TC 吸附效率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 TC 檢測波長的確定

MAA、EGDMA、AIBN 以及TC 的紫外光譜見圖1。

圖1 MAA、EGDMA、AIBN 以及TC 的紫外光譜Fig.1 UV spectra of MAA，EGDMA，AIBN and TC

由圖1 可明顯看出，TC 的最大紫外吸收波長為355 nm；MAA、EGDMA、AIBN 的最大紫外吸收波長分別在306、308、346 nm 處，故后續(xù)試驗(yàn)均以355 nm 作為檢測TC 的最佳波長。

2.2 模板分子洗脫液的確定

洗脫液的選擇對試驗(yàn)結(jié)果有著直接影響。在甲醇中添加一定量的乙酸可以增加溶液的洗脫作用力，破壞模板分子和聚合物之間的結(jié)合力，有效減少模板分子的滲漏，達(dá)到更好的洗脫效果。不同比例洗脫液對MMIPs NPs 的洗脫效果見圖2。

圖2 不同比例洗脫液對MMIPs NPs 洗脫效果的紫外光譜Fig.2 UV spectra of MMIPs NPs eluted with eluents of different ratios

如圖2 所示，經(jīng)甲醇-乙酸溶液（8 ∶2，體積比）洗脫后溶液中TC 含量大于甲醇-乙酸溶液（9 ∶1，體積比）洗脫后的，即前者的洗脫效果優(yōu)于后者；隨著洗脫次數(shù)的增加，不同體積比甲醇-乙酸溶液對TC 的洗脫效果差距逐漸減小。由于甲醇的極性較大，考慮到洗脫時(shí)可能會(huì)破壞分子印跡形成的孔穴，故選擇甲醇-乙酸溶液（8 ∶2，體積比）作為模板分子的洗脫液。

2.3 TC 與MAA 比例的確定

模板分子與功能單體之間的相互作用力的大小直接影響到聚合物的吸附性能，相互作用力越大，特異性越好[25]。因此，合適的模板分子與功能單體比例對MMIPs NPs 的制備尤為重要。不同比例TC 與MAA 制備MMIPs NPs 的吸附性能見表1。

表1 不同比例TC 與MAA 制備MMIPs NPs 的吸附性能Table 1 Adsorption properties of MMIPs NPs prepared by different ratio of TC to MAA

結(jié)果如表1 所示，MMIPs NPs 對TC 的吸附容量、吸附效率及分配系數(shù)均隨著TC 與MAA 摩爾比的增加先是增加然后減少，當(dāng)TC 與MAA 摩爾比為1 ∶8時(shí)，其吸附容量、吸附效率及分配系數(shù)達(dá)到最大，分別為35.30 mg/g、88.25%及3 754.35 mL/g，故選擇TC 與MAA 的摩爾比為1 ∶8 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 羧基化Fe3O4 NPs 添加量的確定

磁性載體的添加量直接影響了MMIPs NPs 的穩(wěn)定性和富集分離待測物的能力。因此，合適的磁性載體添加量對MMIPs NPs 的制備尤為重要。不同羧基化Fe3O4NPs 添加量制備MMIPs NPs 的吸附性能見表2。

表2 不同羧基化Fe3O4 NPs 添加量制備MMIPs NPs 的吸附性能Table 2 Adsorption properties of MMIPs NPs prepared by different additions of carboxyl-modified Fe3O4 NPs

如表2 所示，隨著羧基化Fe3O4NPs 添加量的增加，MMIPs NPs 對TC 的吸附容量、吸附效率及分配系數(shù)也隨之增加，當(dāng)羧基化Fe3O4NPs 添加量為0.5 g 時(shí)，其吸附容量、吸附效率及分配系數(shù)均達(dá)到最大值，分別為35.30 mg/g、88.25%及3 754.35 mL/g，之后再增加羧基化Fe3O4NPs 的添加量，吸附效率開始減小，故選擇羧基化Fe3O4NPs 的最優(yōu)添加量為0.5 g。

2.5 MMIPs NPs 添加量對吸附效率的影響

不同MMIPs NPs 添加量對TC 吸附效率的影響見圖3。

圖3 不同MMIPs NPs 添加量對TC 吸附效率的影響Fig.3 Effect of MMIPs NPs on the adsorption efficiency of TC

如圖3 所示，不同添加量的MMIPs NPs 對TC 的3次平行吸附效率的平均值分別為82.79%、88.85%、91.40%、94.89%、95.01%及95.08%，隨著MMIPs NPs添加量的增加，對TC 的吸附效率也隨之增加。當(dāng)MMIPs NPs 的添加量為10 mg 時(shí)，吸附效率達(dá)到94.89%，而MMIPs NPs 的添加量為15 mg 時(shí)的吸附效率僅比添加量為10 mg 時(shí)提高了0.19%，吸附效率不再顯著增加。從經(jīng)濟(jì)環(huán)保的角度考慮，選擇MMIPs NPs 添加量為10 mg 進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對吸附效率的影響

反應(yīng)時(shí)間對TC 吸附效率的影響見圖4。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對TC 吸附效率的影響Fig.4 Effect of reaction time on the adsorption efficiency of TC

如圖4 所示，不同反應(yīng)時(shí)間3 次平行吸附效率的平均值分別為80.47 %、85.56 %、87.81 %、94.10 %、94.68%及95.03%，隨著MMIPs NPs 與TC 結(jié)合時(shí)間的增加，吸附效率隨之增加。當(dāng)MMIPs NPs 吸附TC 反應(yīng)時(shí)間在40、50、60 min 時(shí)，吸附效率不再顯著增加，反應(yīng)時(shí)間在60 min 時(shí)，吸附效率達(dá)到最高95.03%，時(shí)間較短時(shí)MMIPs NPs 與TC 的結(jié)合不夠充分。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在40 min 時(shí)吸附效率已經(jīng)達(dá)到94.10%，比30 min時(shí)的吸附效率提高了6.29%，且與60 min 時(shí)的吸附效率差別不大。

3 結(jié)論

MMIPs NPs 以其在樣品前處理過程中能快速富集分離待測物、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，已成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。本文以羧基化的Fe3O4NPs 為磁性載體，TC 為模板分子，MAA 為功能單體，EGDMA 為交聯(lián)劑，利用表面分子印跡技術(shù)，對TC 具有特異性識別的MMIPs NPs的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步對MMIPs NPs 富集分離TC 的最優(yōu)吸附效率進(jìn)行研究。結(jié)果表明，所制備的MMIPs NPs 對TC 具有良好的吸附能力，當(dāng)TC 溶液濃度為0.08 mg/mL，體積為2 mL，MMIPs NPs 的添加量為10 mg，反應(yīng)時(shí)間為40 min 時(shí)，吸附效率可達(dá)94.10%。經(jīng)上述條件優(yōu)化后，大大提升了MMIPs NPs 富集分離TC 的能力，且該法制備過程簡單，可快速磁性分離，使得食品中TCs 的富集分離更加簡便高效。