葛云飛，趙舒婷，劉德志，王維浩，2，曹龍奎，2，*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶163319）

高粱又名蜀黍，因其高產(chǎn)性、高抗逆性及其在發(fā)酵、制糖、飼料行業(yè)中用途廣泛而被大量種植，其種植面積及產(chǎn)量僅次于小麥、玉米、水稻和大麥，成為世界上第五大糧食作物[1]，是一種富含膳食纖維，蛋白質(zhì)，脂肪，葉酸，鐵和其他微量元素的天然高營養(yǎng)功能性食品。高粱具有涼血、解毒之功，常吃高粱粥和高粱米飯，可治積食、消化不良等癥，可用于防治多種疾病[2]。在西方國家通常將高粱進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)“高粱粥”、“高粱發(fā)酵飲料”[3]及“高粱斷奶粥”等產(chǎn)品[4]，而在國內(nèi)由于高粱的適口性較差，膳食纖維的含量較高而不易被人體消化吸收，通常將其應(yīng)用于飼料行業(yè)中，使其經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)價值受到限制，發(fā)酵是我國常見改善谷物口感及理化性質(zhì)的方法，因此通過將高粱進(jìn)行自然發(fā)酵處理，不僅可以擴(kuò)大高粱的應(yīng)用范圍，更能提高高粱的食用品質(zhì)。目前國內(nèi)外對發(fā)酵高粱研究主要集中在發(fā)酵高粱淀粉的理性化質(zhì)、凝膠特性[5]及體外淀粉消化率[6]等，但對發(fā)酵高粱的微生物菌群結(jié)構(gòu)變化涉略較少。發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、淀粉酶類、醇類等小分子物質(zhì)作用于高粱淀粉顆粒，改善高粱淀粉的理化性質(zhì)，使高粱的營養(yǎng)價值提高，并賦予發(fā)酵高粱產(chǎn)品特殊風(fēng)味改善其口感。

對于傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的微生物研究通常采用實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，生理生化反應(yīng)定向鑒定菌種，但由于實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)的微生物種類僅占樣品環(huán)境的1%~10%左右，因此通過實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)不能進(jìn)一步分析傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的微生物群落構(gòu)成、群落演替以及各種微生物的代謝特性[7]，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)酵微生物菌落變化研究不在需要通過純培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行，大大減少了試驗(yàn)工作量并為不可培養(yǎng)微生物的研究提供契機(jī)。宏基因組學(xué)利用現(xiàn)代基因技術(shù)，涵蓋生物信息統(tǒng)計(jì)分析和基因組學(xué)兩方面的意義和技術(shù)[8]，宏基因組學(xué)以基因組技術(shù)為基礎(chǔ)通過對環(huán)境中全部DNA 系統(tǒng)全面的研究，以揭示發(fā)酵過程中微生物的菌落交替、相互作用關(guān)系及生理生化功能[9]。因此本文利用宏基因組技術(shù)研究自然發(fā)酵高粱過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化，代謝通路，為工廠化自發(fā)酵高粱產(chǎn)品調(diào)控提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱：山東臨沂；DNA 提取試劑盒：上?？婆d責(zé)任有限公司；Tris 硼酸、瓊脂糖凝膠、核酸染料、TE 緩沖液和DNA Marker：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒：AXYGEN 公司；蒸餾水：國家雜糧技術(shù)研究中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Dgg-9053A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MJ-10A 型磨粉機(jī)：上海市浦恒信息科技有限公司；PTC-200 型梯度擴(kuò)增PCR 儀、CDS-8000 型凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Bio-Rad 公司；GS-FLX 型高通量測序儀：美國Roche454 公司；DYY-12 型電泳儀：北京六一儀器廠；Qubit2.0 熒光計(jì)：沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司；LS-3781L-PC 型高壓滅菌鍋：日本松下健康醫(yī)療器械株式會社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將高粱進(jìn)行自然發(fā)酵0~15 d，取發(fā)酵前期（3 d）、發(fā)酵中期（8 d）、發(fā)酵后期（14 d），裝入無菌離心管中，送去宏基因組高通量測序。

1.3.2 樣品總DNA 的提取

根據(jù)DNA 試劑盒說明書所示標(biāo)準(zhǔn)步驟，進(jìn)行提取，具體操作步驟如下：

1）稱取發(fā)酵液樣品1 g 于2 mL 離心管中，加入0.8 mL SLX Mlus 緩沖溶液，振蕩混勻5 min。

2）加入80 μL DS 緩沖液并且振蕩混勻。

3）恒溫金屬浴70 ℃裂解10 min。

4）25 ℃室溫下離心5 min（13 000 r/min）。

5）吸取離心后上清液600 μL 于2 mL 無菌離心管中，加入200 μL SP2 緩沖液，振蕩混勻。

6）加入100 μL HTR 試劑，混勻10 s 后進(jìn)行冰浴5 min。

7）25 ℃室溫離心5 min（13 000 r/min）。

8）吸取離心后上清液400 μL 于2 mL 無菌離心管中，加入450 μL Binding 緩沖液和40 μLMagsi Particles溶液，振蕩混勻，25 ℃下靜置2 min。

9）將2 mL 離心管放置在磁力架上吸附5 min，小心吸棄上層清液，并且移開。

10）加入500 μL Binding 緩沖液，振蕩混勻，25 ℃室溫放置2 min。

11）將2 mL 離心管放置在磁力架上吸附5 min，小心吸棄上層清液，并且移開。

12）加入1 000 μL PHB 緩沖液，振蕩混勻磁珠，放置在磁力架5 min，棄上清。

13）加入1 000 μL SPM Wash 緩沖液，混勻磁珠，放置在磁力架5 min，棄上清。

14）重復(fù)步驟（13）即加入1 000 μL SPM 緩沖液，混勻磁珠，放置在磁力架5 min，棄上清。

15）將2 mL 離心管于55 ℃烘箱中烘10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)。

16）加入60 μL Elution 緩沖液到離心管中，充分震蕩混勻，65 ℃金屬浴10 min。

17）磁力架吸附5 min，小心吸取上清DNA 液體到新的1.5 mL 離心管中。

1.3.3 樣品DNA 測序文庫構(gòu)建

1.3.3.1 樣品基因組DNA 片段化

將不同發(fā)酵時期發(fā)酵液樣品進(jìn)行DNA 片段化，制備插入片段長度為500 bp 左右的文庫，初始DNA 總量為800 ng，使用Elution 緩沖液將DNA 稀釋到130 uL，裝入0.5 mL 的DNA 打斷管中，將DNA 片段化，即使最后打斷的DNA 片段大小集中在300 bp~500 bp 范圍內(nèi)。使用核酸純化磁珠將破碎后的DNA 片段濃縮回收。

1.3.3.2 樣品基因組DNA 濃度測定

1.3.3.3 樣品基因組DNA 片段末端修復(fù)及連接接頭

通過Illumina 公司試劑盒進(jìn)行建庫，其具體操作步驟如下：

1）將超端準(zhǔn)備酶和末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液置于冰上解凍。

2）分別加入（綠色）端預(yù)酶混合物試劑3.0 μL、（綠色）末端修復(fù)反應(yīng)緩沖試劑6.5 μL、片段化DNA 試劑55.5 μL 于不同發(fā)酵時期樣品片段化后DNA 中。

3）使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4）將上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）管置于PCR 儀，熱蓋設(shè)置為≥75 ℃，并運(yùn)行以下程序：20 ℃保持30 min、65 ℃保持30 min。

5）將DNA 連接酶，連接增強(qiáng)劑和轉(zhuǎn)接酶置于冰上解凍。

6）分別加入（紅色）DNA 連接酶試劑15 μL、（紅色）連接增強(qiáng)劑試劑1 μL、轉(zhuǎn)接酶試劑2.5 μL。

7）使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

8）將上述PCR 管置于PCR 儀，并運(yùn)行以下程序：20 ℃保持15 min。

1.3.3.4 純化后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增富集

1）渦旋振蕩混勻核酸純化磁珠。

2）根據(jù)DNA 片段長度要求，向100 μL DNA 上清液中分兩次加入磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10 次混勻，25 ℃孵育5 min。

3）將PCR 管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清，加入200 μL 新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠兩次。

4）將PCR 管從磁力架中取出，加入適量21 μL 雙蒸水，渦旋振蕩充分混勻，25 ℃靜置5 min。

5）將PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，將20 μL 上清液轉(zhuǎn)移至干凈無菌管中。

6）向無菌管中加入DNA 片段連接酶試劑20 ng、（藍(lán)色）熱啟動聚合酶鏈反應(yīng)母液試劑20 μL、Index Primer/i7 Primer（50 μmol/L）和Universal PCR Primer/i5 Primer（50 μmol/L）試劑各1 μL。

7）使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底后將PCR 管置于PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

8）所得PCR 產(chǎn)物用2 g/100 mL 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過不同軟件對微生物多樣性、基因組裝及基因功能注釋技術(shù)路線將樣品測序得到的原始序列經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控之后，進(jìn)行組裝、注釋公共數(shù)據(jù)庫等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵樣品總DNA 的提取

發(fā)酵樣品總DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知發(fā)酵樣本主條帶清晰，無明顯拖尾且濃度較高，說明發(fā)酵樣品不存在降解，污染，3 個樣品對應(yīng)位置的條帶大小正確，濃度合適，為后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供了保障，由此可證明擴(kuò)增片段可用于Illumina雙末端測序。

發(fā)酵樣品的DNA 濃度檢測結(jié)果如表1 所示。

發(fā)酵樣品總DNA 的濃度均達(dá)到了測序標(biāo)準(zhǔn)，因此可以構(gòu)建二代測序文庫，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 發(fā)酵樣品Illumina 測序數(shù)據(jù)處理

發(fā)酵樣品的高通量測序檢測結(jié)果如表2 所示。

圖1 發(fā)酵樣品總DNA 的提取Fig.1 Extraction of total DNA from fermentation samples

表1 發(fā)酵樣品總DNA 的濃度Table 1 Total DNA concentration of fermentation sample

不同發(fā)酵時期所得序列數(shù)分別為4.7×107、7.9×107、4.5×107，為了保證信息分析質(zhì)量，將測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到清晰數(shù)據(jù)，將所得優(yōu)質(zhì)reads 利用拼接軟件IDBA_UD 進(jìn)行拼接組裝，根據(jù)序列間的重疊關(guān)系，獲得一定數(shù)目的重疊數(shù)，并對多個組裝結(jié)果進(jìn)行了綜合評定，選擇最佳組裝結(jié)果[10]。對拼接的拼接重疊數(shù)序列進(jìn)行開放閱讀框（open reading frame，ORF）預(yù)測，選擇長度大于等于100 bp 的基因，并將其翻譯成蛋白序列以便后續(xù)物種注釋及京都基因百科全書與基因組（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能注釋進(jìn)行研究分析。

表2 高通量測序結(jié)果Table 2 High throughput sequencing results

基因在不同樣本間會出現(xiàn)基因個數(shù)及豐富度有差異的現(xiàn)象，香農(nóng)維納（Shannon-Wiener）指數(shù)與辛普森（Simposon）指數(shù)被用來表征微生物基因多樣性。香農(nóng)維納指數(shù)為物種種類數(shù)目，即豐富度又稱為種類中個體分配上的平均性，樣本種類數(shù)目多，其樣本的多樣性越高。同樣，種類之間個體分配的均勻性增加也會是多樣性的提高。如果每一個個體都屬于不同的種，多樣性指數(shù)就最大；如果每個個體都屬于同一種，則多樣性指數(shù)就最小。而辛普森指數(shù)為隨機(jī)取樣的兩個個體屬于不同種的概率，群落中種屬越多，各種個體分配越均勻，指數(shù)越高，表明多樣性越好。由表2 可知在發(fā)酵不同時期其香濃維納指數(shù)呈先增加后降低的趨勢，而辛普森指數(shù)為先降低后增加，說明隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的微生物群落中種屬類別呈先增加后降低的趨勢，在發(fā)酵中期微生物種屬較多、菌屬的豐富度較大即發(fā)酵樣本多樣性較高。

2.3 發(fā)酵樣品菌群結(jié)構(gòu)及菌種比例分析

將基因集蛋白序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息。同時根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）的微生物分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，獲得基因的物種分類注釋信息，其中高粱在不同發(fā)酵時期的微生物菌群在物種分類學(xué)水平上的相對豐度如圖2所示。

圖2 自然發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes in bacterial structure during natural fermentation

在高粱自然發(fā)酵前期過程中，豐富度大于1%的菌群結(jié)構(gòu)如下：乳酸乳球菌的豐富度較高，達(dá)到26.54%、乳桿菌屬含量約為22.68 %、其次是腸桿菌屬含量1.59%、固氮菌株豐富度為5.27%，隨著發(fā)酵時間的延長當(dāng)發(fā)酵時間為8 d 即發(fā)酵中期時酵母菌的豐富度高達(dá)36.47%、植物乳桿菌及戊糖片球菌為發(fā)酵中期乳酸菌的主要菌種，其中植物乳桿菌的豐富度較發(fā)酵前期高出7.26%，腸桿菌屬豐富度上升至2.65%、而在發(fā)酵后期即自然發(fā)酵14 d 時葡糖醋桿菌屬豐富度最高，其中Gluconacetobacter diazotrophicus（固氮葡糖醋桿菌）菌種含量為45.54%，醋桿菌屬的豐富度隨發(fā)酵時間的延長而增加至11.38%，此時發(fā)酵液產(chǎn)生較大的刺激性酸味、酸度增加，說明高粱在自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌為乳酸菌及酵母菌，Michael G 等[11]通過將高粱進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)酸面團(tuán)研究發(fā)現(xiàn)其中優(yōu)勢菌種為羅伊氏乳桿菌，植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌及干酪乳桿菌，棒狀乳桿菌等，而Sedjro Emile Tokpohozin 等[12]通過基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜獲得的蛋白質(zhì)組分析高粱啤酒中的優(yōu)勢菌為發(fā)酵乳桿菌，植物乳桿菌，瑞士乳桿菌，副干酪乳桿菌和短乳桿菌等，Jialiang Xu 等[13]通過宏基因組分析高粱米酒中優(yōu)勢菌屬為寡養(yǎng)單胞菌屬，蛭弧菌屬，溶藻屬，硫磺菌屬和無色桿菌等，本文通過將高粱進(jìn)行自然發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種為胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、費(fèi)比恩畢赤酵母（Cyberlindera fabianii）、醋酸桿菌（Acetobacter malorum）、固氮葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）等，說明在高粱自然發(fā)酵的過程中酵母菌是慢慢富集的過程，在發(fā)酵過程之中乳酸菌的大量存在增加了酵母菌的代謝潛能[14]，而在發(fā)酵后期醋桿菌屬的大量富集使酵母菌豐富度下降，說明畢赤酵母等酵母菌耐酸性較差。

2.4 發(fā)酵樣品菌群主要代謝通路分析

發(fā)酵樣品中主要代謝通路及主成分分析結(jié)果如表3 所示。

表3 發(fā)酵樣品中主要代謝通路及主成分分析Table 3 Main metabolic pathways in fermentation samples

使用GhostKOALA[15]將基因集蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到序列對應(yīng)的基因數(shù)據(jù)庫（KEGG orthology，KO）基因號，根據(jù)KO 與通路和模塊的聯(lián)系得到序列的通路，模塊注釋信息，包括代謝通路、合成通路、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳遞、細(xì)胞周期以及疾病相關(guān)通路等，并統(tǒng)計(jì)KEGG 各功能層級在各個樣本中的豐富度。其結(jié)果如下：

在高粱自然發(fā)酵的過程中，微生物菌群的代謝結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨著發(fā)酵時間的延長，氨基酸代謝、碳水化合物代謝等基因數(shù)目較大，而發(fā)酵后期基因數(shù)目有一定程度的降低，通過宏基因組序列的代謝重建，揭示了蛋白質(zhì)和碳水化合物異養(yǎng)發(fā)酵的特征，與檢測到乙醇和pH 值下降相符即發(fā)酵隨著發(fā)酵時間的延長醋酸菌屬的豐富度增加，使整個發(fā)酵體系的酸度增加pH值下降，使微生物生長的抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，其中乳酸菌和醋酸菌自身具有一定的醋酸耐受力，逐漸成為豐度較高的主體微生物，而通過代謝途徑可知，碳水化合物代謝主要途徑為三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、磷酸戊糖和糖酵解途徑等[16]，其中間代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生大量的檸檬酸、乙酸、丁酸等有機(jī)酸亦使溶液的pH 值逐漸降低。因此，除加工技術(shù)（麥芽化，糖化），高粱麥芽汁組成之外，發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸，醇）和pH值等因素決定了發(fā)酵劑微生物菌群結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

通過紅宏基因組技術(shù)分析高粱在自然發(fā)酵過程中菌群演替變化及優(yōu)勢菌群的代謝途徑和特定功能的基因數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌種為胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、費(fèi)比恩畢赤酵母（Cyberlindera fabianii）、醋酸桿菌（Acetobacter malorum）、固氮葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）等，其中酵母菌的豐富度隨著發(fā)酵時間的延長而增加，而發(fā)酵后期醋桿菌屬的大量富集使整個發(fā)酵體系顯酸性，說明發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種為耐酸性菌種，其中發(fā)酵體系中醋酸菌的豐度較高，由于其具有較強(qiáng)的氧化能力，能夠較快地將乙醇氧化為醋酸[17]，使發(fā)酵液pH 值降低。通過功能注釋聚類分析結(jié)果得知，高粱自然發(fā)酵過程中主要功能信息包括微生物代謝通路、合成通路、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳遞、細(xì)胞周期以及疾病相關(guān)通路等，其中間代謝產(chǎn)物有機(jī)酸等為微生物的繁殖生長提供了有利條件。本試驗(yàn)通過高通量測序的宏基因?qū)W分析高粱發(fā)酵過程中的微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步明確發(fā)酵高粱中微生物的群落結(jié)構(gòu)演替、相互作用，同步確定各種微生物的豐度，通過了解高粱自然發(fā)酵過程中的代謝機(jī)理，并挖掘出新的功能基因，對高粱自然發(fā)酵的工廠化生產(chǎn)及品質(zhì)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。