陳春玲，閆呂彬，牛 伢，吳嫦麗，張秀娟*（廣東醫(yī)科大學 . 生理學教研室；. 圖書館，廣東湛江 5403）

54 kDa核DNA、RNA結合蛋白(54kDa nuclear RNA-and DNA-binding protein，p54nrb)也稱Non-POU domain containing octamer-binding protein(NONO)，是一種主要分布于細胞核，且能與DNA、RNA結合的多功能核蛋白[1]。在細胞核內，p54nrb參與多種核內生物學過程，如初級mRNA的剪接[2]、DNA的損傷修復[3]、DNA解螺旋[4]、基因的轉錄調控[5]、缺陷RNA核滯留等[6]，p54nrb基因突變或異?？梢饛V泛的基因mRNA譜表達異常。p54nrb是核蛋白體結構paraspeckle的核心組成蛋白[8-9]，paraspeckle的功能是參與A-I超編輯RNA的核滯留過程。p54nrb核內功能的多樣性決定了其生物功能的多樣性，可參與生物節(jié)律的調節(jié)[10]，并與神經系統(tǒng)發(fā)育[11]及腫瘤的發(fā)生、轉移等密切相關[12-14]。為了進一步研究p54nrb基因的功能，我們構建了p54nrb基因真核表達載體，并觀察了其在人肝癌細胞HepG2內表達，為后續(xù)研究p54nrb基因的生物功能提供載體。

1 材料和方法

1.1 材料

pcDNA3-HA及pcDNA3質粒、HepG2 細胞由廣東醫(yī)科大學生理學教研室保存。鼠抗HA單克隆抗體購自sigma公司；Alexa-Flour 488 標記的羊抗鼠IgG抗體購自中杉金橋。ReverTra Ace-α-? kit、XhoI和KpnⅠ限制性核酸內切酶、Ligation High DNA連接酶、KOD-Plus-Neo酶購于TOYOBO公司；Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑購于Invitrogen公司；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購于Aidlab 公司；總RNA提取試劑盒購于Axygen公司；胎牛血清及培養(yǎng)基購于Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞總RNA的提取 將對數生長期的HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，在細胞生長至80%～90%融合時，收取細胞，按Axygen總RNA制備試劑盒使用說明書提取總RNA。

1.2.2 RT-PCR擴增人p54nrb基因的蛋白編碼序列提取總RNA，并以總RNA為模板反轉錄合成cDNA。取反轉錄生成的cDNA 2 μL，PCR擴增人p54nrb基因的蛋白編碼序列，PCR反應的上游引物為：5'- CGG GGTACCATGCAGAGTAATAAAACTT TTAACTTG G-3'；下游引物：5'- CCGCTCGAGGTATCG G CGA CGTTTGTTTGG -3'；其中GGTACC為KpnI 酶切位點，CTCGAG為XhoI 酶切位點。PCR 反應條件設定為94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，68 ℃、2 min，40個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳，使用天能凝膠圖像分析系統(tǒng)對凝膠進行照相。使用Axygen DNA凝膠回收試劑盒切膠回收p54nrb PCR產物。

1.2.3 pcDNA3-p54nrb-HA載體的構建及鑒定 使用XhoI和KpnI限制性內切酶對p54nrb RT-PCR擴增產物及pcDNA3-HA質粒分別進行雙酶切，并將酶切產物切膠回收，用DNA連接酶將酶切產物在16 ℃下連接16 h；然后將連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細菌，用氨芐霉素抗性的瓊脂板進行陽性克隆的篩選。挑取陽性克隆，LB培養(yǎng)基中搖菌14 h，然后提取質粒。用XhoI和KpnI限制性內切酶對重組質粒進行雙酶切初步鑒定，鑒定正確后再將該質粒送至華大基因公司測序。所構建的質粒命名為pcDNA3-p54nrb-HA。

1.2.4 細胞培養(yǎng)及質粒轉染 HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。將1×104個HepG2細胞接種于Petri皿中，待細胞生長至融合度達到70%～80%時進行質粒轉染，其過程如下：將0.2 μg pcDNA3-p54nrb-HA或pcDNA3-HA陰性對照質粒加入到23 μL OPTI-DMEM培養(yǎng)基，混勻后再加入1 μL Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑，室溫環(huán)境中孵育10 min。將150 μL含10% FBS的1640培養(yǎng)液與質粒-脂質體混合物混勻后加入Petri皿中，轉染完后將細胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 細胞免疫熒光檢測 HepG2細胞轉染pcDNA3-p54nrb-HA質粒24 h后進行細胞免疫熒光實驗。用PBS洗滌細胞1次；用4 %多聚甲醛固定細胞15 min，用PBS洗滌細胞1次；向細胞加入含有0.1 % Triton X-100的PBS，室溫下孵育5 min，用PBS漂洗細胞3次；1‰ 硼氫化鈉孵育5 min；用含3 % BSA的PBS室溫封閉細胞1 h，然后再用0.1 % Triton X-100/ PBS洗滌細胞1次；加入鼠源性抗HA一抗抗體(稀釋比為1:100)，4 ℃孵育過夜，0.1% Triton X-100/PBS 漂洗3次；加入Alexa-Flour 488 標記的羊抗鼠IgG熒光二抗，稀釋比為1:1 000)，室溫避光孵育1 h，漂洗3 次； DAPI/PBS核染色10 min，洗滌細胞2 次，然后用PBS封片并在熒光顯微鏡下觀察及照相。

2 結果

2.1 pcDNA3-p54nrb-HA載體的構建及鑒定

通過RT-PCR擴增p54nrb基因的蛋白編碼區(qū)后，對擴增產物進行凝膠電泳，可見在1 400 bp左右處出現清晰條帶，與1 461 bp p54nrb目的片段大小相符。對質粒pcDNA3- p54nrb-HA進行雙酶及回收酶切產物凝膠電泳后，可見約1.4 kb和5.4 kb大小條帶(圖1)。pcDNA3-p54nrb-HA質粒測序結果與GenBank所提供的人p54nrb蛋白編碼區(qū)基因cDNA 序列(GenBank: CR456761.1)一致(圖2)，說明該質粒構建成功。

2.2 細胞免疫熒光檢測p54nrb在細胞內表達和定位

轉染pcDNA3-p54nrb-HA質粒后，靜息狀態(tài)下綠色熒光只分布于細胞核，如圖3所示。

3 討論

圖1 p54nrb蛋白編碼區(qū)的PCR擴增及pcDNA3-p54nrb-HA質粒的酶切鑒定

NONO/p54nrb屬于果蠅行為/人類剪接蛋白(drosophila behavior/human splicing,DBHS)家族中的一員。DBHS蛋白幾乎參與基因調控的每一個步驟，包括轉錄調控，RNA加工和運輸，以及DNA修復等?，F在研究表明，DBHS蛋白是動態(tài)蛋白質家族，它介導了廣泛的蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸相互作用，總體上可作為一個多用途的分子支架，該家族在細胞生物學中作用復雜而且重要[15]。p54nrb蛋白可以單獨或與其他轉錄因子協(xié)同作用，與雙鏈或單鏈DNA以及單鏈RNA作用，參與基因轉錄的激活或抑制，轉錄的起始、延伸或終止，以及轉錄后的加工和輸出等多個步驟[1]，如p54nrb/NONO與視紫紅質增強子區(qū)結合，增強視紫紅質啟動子轉錄活性，促進視紫紅質的表達[16]。p54nrb作為孕激素受體(Progesterone Receptor,PR)轉錄阻遏物抑制PR介導的孕激素反應元件的反式激活，引起下游RNA的降解可以促進轉錄的終止[6]。p54nrb基因敲除削弱了ERK激活，進而抑制RNA聚合酶在小鼠胚胎干細胞雙線期基因靶點的定位，擾亂了靶基因的激活。NONO/p54nrb參與雙鏈DNA的解螺旋，p54nrb與剪接因子PSF與形成異源二聚體，結合DNA拓撲異構酶I，增強DNA拓撲異構酶I活性。p54nrb還參與超編輯RNA核滯留和DNA損傷修復等。

圖2 pcDNA3-p54nrb-HA質粒的測序結果

圖3 p54nrb在HepG2細胞的表達與定位(200×)

由于p54nrb參與了基因的復制、轉錄和轉錄后mRNA的剪切等多個過程，p54nrb基因突變或異常可引起廣泛的基因mRNA譜表達異常，其表達或功能異常與多種生理以及病理疾病有關。有研究表明p54nrb基因可能參與膠原蛋白代謝過程。NONO 作為晝夜節(jié)律蛋白PERIOD(PER)的分子伴侶參與衰老和細胞周期的調控。NONO對于局部樹突的形態(tài)和橋接蛋白的結構有重要作用；p54nrb/NONO可能是一個影響神經發(fā)育的重要基因，該基因突變或缺失可能與人智力低下的疾病有關，p54nrb缺陷小鼠有認知和情感缺陷[11]?，F研究表明，NONO參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如p54nrb與乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、膀胱移行細胞癌、惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、紅白血病等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關[12-14]。p54nrb功能的多樣性，促使學者們對其功能進行深入研究，本實驗成功地克隆了人p54nrb基因真核表達載體，并通過轉染實驗證實p54nrb分布于細胞核。該載體的構建，將為后續(xù)進一步研究p54nrb功能提供重要工具。