黃維甄，李 俊，董少婷，謝 丹 （廣東省惠州市中心人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東惠州 516000）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康[1]。手術(shù)是目前根治胃癌的主要方法。然而，胃癌術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率仍然很高，中位生存期僅有7.5～12個月[2]。因此，尋找胃癌中的關鍵調(diào)控基因及探究其作用機制，有望為胃癌的防治提供新思路和新靶點。Tribble同源蛋白3(TRIB3)是一種重要的應激相關蛋白[3]，在細胞凋亡、脂肪細胞分化、細胞應激等過程中發(fā)揮著重要作用[4]。研究表明，TRIB3在乳腺癌[5]、結(jié)直腸癌[6]、肺癌及肝癌[7]等腫瘤組織中高表達，并與患者的不良預后密切相關，提示TRIB3可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控基因。本文就TRIB3是否參與胃癌進展及其具體作用機制作一研究。

1 資料和方法

1.1 收集資料

利用Cbioportal在線軟件(https://www.cbioportal.org/)分析TRIB3基因在不同腫瘤中的突變情況，選擇TCGA Pan Cancer Altlas Studies數(shù)據(jù)集進行TRIB3基因突變情況分析。

1.2 分析胃癌中TRIB3的表達

分別從The Cancer Genome Atlas Program(TCGA，https://www.cancer.gov/)和 Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載含胃癌mRNA表達的數(shù)據(jù)集(GSE79973)，以分析TRIB3在胃癌及癌旁組織中的表達情況。

1.3 分析TRIB3表達與胃癌患者預后的關系

利用Kaplan-Meier Plotter在線軟件(http://kmplot.com/analysis/)分析TRIB3表達與胃癌患者預后的關系，TRIB3高低表達的截取值為系統(tǒng)自動選擇最佳截取值。

1.4 主要試劑和材料

胃癌細胞株BGC823和MKN45由本實驗室提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；CCK-8試劑由日本同仁公司生產(chǎn)；RIPA裂解液、蛋白酶體抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA試劑盒等購自碧云天公司；siRNA由廣州銳博公司設計并合成；TRIB3過表達慢病毒購自上海吉凱公司；Lipofectamine RNAiMAX購自英濰捷基；抗體購自Abcam；ChIP試劑盒購自賽默飛公司；western blot發(fā)光系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.5 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞株BGC823、MKN45培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中；細胞均在37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d換液、傳代。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的BGC823和MKN45細胞，以1 000 個/孔接種于96孔板中，每孔設3個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集相應時間點細胞，棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含有10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，450 nm吸光值，繪制生長曲線。

1.7 western blot檢測蛋白表達

細胞相應處理后，用PBS清洗2次后，收集細胞，6孔板每孔加入100 μL RIPA裂解液抽提細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度；5×上樣緩沖液與總蛋白以5:1混合后，95～100 ℃加熱5～10 min。取出20 μg蛋白質(zhì)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓100 V將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%BSA封閉1 h后，相應一抗孵育蛋白，4 ℃搖床孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次5 min，對應二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用Bio-Rad化學發(fā)光系統(tǒng)顯色成像。

1.8 蛋白質(zhì)免疫共沉淀

細胞相應處理后，取1×107個細胞，用1 mL含適量蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的western和IP裂解液裂解細胞，靜置30 min后15 000 g ×15 min離心取上清，加入相應一抗，4 ℃搖床孵育過夜，加入20 μL Protein A/G瓊脂糖珠子孵育30 min，用western和IP 裂解液裂解洗珠子5次，2×上樣緩沖液洗脫蛋白質(zhì)結(jié)合復合物，95 ℃加熱10 min變性，繼續(xù)后續(xù)western blot實驗。

1.9 免疫熒光

細胞爬片作相應處理后，PBS洗細胞爬片2遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗細胞爬片2遍，0.25% 曲拉通打孔5 min，PBS洗細胞爬片2遍，山羊血清封閉1 h，相應一抗4 ℃ 孵育過夜，PBS洗細胞爬片2遍，室溫孵育二抗1 h，PBS洗細胞爬片2遍，DAPI三合一封片劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.10 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

將胃癌細胞接種于10 cm大皿中，加入37%甲醛使甲醛終濃度達1%，室溫孵育10 min，加入2.5 mol/L甘氨酸室溫孵育5 min終止交聯(lián)。用含蛋白酶抑制劑的PBS洗細胞2次，收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的SDS Lysis buffer裂解細胞，超聲破碎(VCX750，25%功率，沖擊4～5 s，間隙9 s，共14次)。14 000 g離心10 min，取上清，留取部分細胞裂解液，剩余部分上清加入5 μg相應抗體，4 ℃搖床孵育過夜，加入20 μL Protein A/G瓊脂糖珠子孵育30 min，清洗磁珠5次，解交聯(lián)，回收DNA片段，PCR檢測。ChIP PCR引物見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.11 siRNA轉(zhuǎn)染

由廣州銳博公司設計并合成特異性敲除TRIB3、β-catenin的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。利用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將相應的siRNA轉(zhuǎn)染入胃癌細胞中。

1.12 構(gòu)建TRIB3穩(wěn)定過表達細胞株

由上海吉凱公司設計并合成TRIB3過表達慢病毒，慢病毒感染按吉凱公司慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作。待感染TRIB3過表達慢病毒后，利用嘌呤霉素篩選TRIB3陽性克隆，2周后收集細胞，提取細胞總蛋白檢測TRIB3表達情況。

1.13 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIB3在胃癌中的表達情況及其與預后的關系

TRIB3在多種腫瘤中均出現(xiàn)不同程度的擴增或者突變(圖1A)。與癌旁組織相比，TRIB3在胃癌組織中顯著高表達(圖1B)，差異有統(tǒng)計學意義(TCGA：P<0.01，GSE79973：P<0.05)。TRIB3高表達的患者其總生存及無進展生存時間明顯較TRIB3低表達患者的總生存及無進展生存時間短(圖1C，P<0.01)。

2.2 TRIB3對胃癌細胞增殖的影響

過表達TRIB3能明顯促進胃癌細胞的增殖(圖2A)，而干擾TRIB3能明顯抑制胃癌細胞的增殖(圖2B)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 TRIB3與β-catenin對c-Myc、CyclinD1的影響

過表達TRIB3能上調(diào)β-catenin及其下游靶基因c-Myc、CyclinD1的表達(圖3A)。免疫共沉淀顯示TRIB3能 與 β-catenin結(jié)合 (圖3B)。 免疫熒光顯示TRIB3與β-catenin存在明顯的共定位(圖3C)。過表達TRIB3能夠促進β-catenin與c-Myc、CyclinD1啟動子區(qū)結(jié)合(圖3D，P<0.01)。

2.4 TRIB3通過β-catenin促進胃癌細胞的增殖

過表達TRIB3能明顯促進胃癌細胞的增殖(P<0.01)，敲除β-catenin能抑制胃癌細胞的增值(P<0.01)，且沉默β-catenin能消除過表達TRIB3對胃癌細胞增殖的促進作用(P<0.01)，見圖4。

圖1 TRIB3在胃癌中的表達情況及其與預后的關系

圖2 TRIB3對胃癌增殖的影響

圖3 TRIB3與β-catenin結(jié)合促進c-Myc、CyclinD1的表達

3 討論

TRIB3是一種沒有激酶活性的假激酶蛋白，其在腫瘤表達及進展中的作用存在爭議[8]。有研究表明TRIB3作為NF-kB的負性調(diào)控因子能夠抑制腫瘤進展[9]，而Hua等[10]發(fā)現(xiàn)TRIB3能夠通過與SMAD3結(jié)合促進TGF-β誘導的腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移。那么TRIB3在腫瘤中的表達情況究竟如何呢？我們利用Cbioportal在線軟件分析TRIB3基因在不同腫瘤中的突變情況，結(jié)果顯示TRIB3在多種腫瘤中均出現(xiàn)不同程度的擴增或者突變，尤其在卵巢癌、子宮癌及肺鱗癌中突變率最高，提示TRIB3在多種腫瘤中均可能存在異常表達。

TRIB3在胃癌中的表達及功能研究報道較少，那么TRIB3在胃癌中表達如何，其與胃癌進展之間是否存在關聯(lián)？本研究通過分析TCGA、GSE79973數(shù)據(jù)集中TRIB3在胃癌及癌旁組織中的表達情況，明確TRIB3在胃癌中顯著高表達，且其高表達與胃癌患者不良預后有關。功能分析發(fā)現(xiàn)TRIB3能夠促進胃癌細胞的增殖。這些實驗結(jié)果提示TRIB3可能作為癌基因促進胃癌細胞的增殖，且TRIB3可能作為胃癌患者不良預后的分子指標。由于本實驗部分結(jié)果是基于公共數(shù)據(jù)分析所得，未來仍需要結(jié)合臨床實驗進一步驗證TRIB3是否可以作為胃癌患者不良預后的分子標記物。

圖4 TRIB3通過β-catenin促進胃癌細胞的增殖

Wnt/β-catenin信號通路在正常細胞的增殖、分化、發(fā)育和維持中起關鍵作用，且在胃癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的生物學作用[11-12]。Wnt/βcatenin信號通路可啟動下游靶基因(如c-Myc、CyclinD1、COX-2等)的轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤細胞增殖。研究表明結(jié)直腸癌中的TRIB3通過與β-catenin結(jié)合維持結(jié)直腸癌腫瘤干細胞的特性。而TRIB3是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌的進展目前仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)TRIB3能夠上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因Myc和CyclinD1 的表達，而Myc和CyclinD1與胃癌細胞的增殖密切相關，且TRIB3可以與β-catenin結(jié)合，進一步促進β-catenin與下游靶基因c-Myc、CyclinD1的啟動子區(qū)結(jié)合，并促進二者轉(zhuǎn)錄激活，進而促進胃癌細胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)為進一步理解胃癌的發(fā)展機制提供了新的理論依據(jù)，有望為胃癌的防治提供新思路和新靶點。