唐月連，陳 權(quán)，李曉毅，王 穎，陳鴻鵬，劉肖雨1,，趙 威，劉玉婷，陳藝琳1,，劉新光，孫雪榮（廣東醫(yī)科大學 1. 東莞科研中心衰老研究所，2. 醫(yī)學檢驗學院，3. 信息工程學院，. 第二臨床醫(yī)學院，5. 藥學院，6. 基礎醫(yī)學院，7. 廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東東莞523808；8. 生物化學與分子生物學研究所，廣東湛江 52023）

在貼壁細胞體外培養(yǎng)的過程中，經(jīng)常需要進行傳代[1-2]。在傳代過程中，細胞懸液種板后，細胞貼壁和分布是否均勻，是影響細胞功能及后續(xù)實驗的重要因素[3-5]，如何使細胞分布均勻是至關(guān)重要的問題。由于目前缺乏統(tǒng)一且標準化的細胞均勻分布的方法或儀器，科研人員大多通過手工或生物搖床對培養(yǎng)板等進行搖動，以達到細胞均勻分布，但是每個人的操作手法不一樣，搖床的參數(shù)也各不相同，效果也參差不齊。哪種搖動方式更容易使細胞均勻分布？目前尚未見研究報道。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，使液體在垂直方向做相對運動，即“十”字軌跡運動，能使細胞分布較好。因此，為了比較不同搖動方式對細胞分布的影響，本文通過手工或搖床對種板后的細胞懸液進行搖動，比較并篩選出能使細胞均勻分布的搖動方式，為科研工作者做細胞傳代提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

胎牛血清；DMEM生長液；黑色素瘤A375細胞購自中國科學院上海細胞庫；胰酶；12孔板；100 mm培養(yǎng)皿；普通生物搖床(WD-9405D)購自北京六一生物科技有限公司；倒置相差顯微鏡(TS100,Nikon)。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代和種板 用含10%胎牛血清的DMEM生長液培養(yǎng)黑色素瘤A375細胞(中國科學院上海細胞庫)，待細胞生長至約80%融合后，經(jīng)胰酶消化和生長液中和后，離心去上清，再用生長液重懸。分別取含5×104和5×105細胞重懸液，種板于12孔板或100 mm培養(yǎng)皿中，用不同的搖動方式混勻細胞后，置于37 ℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后在倒置相差顯微鏡(TS100，Nikon)下觀察和拍照。

1.2.2 細胞懸液的搖動方式 細胞懸液種板后，采用不同的搖動方式混勻細胞，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個實驗至少重復3次。本研究采用了3種不同的搖動方式：(1)不規(guī)則搖動，細胞種板后，不做特殊處理，簡單搖晃后置入培養(yǎng)箱中；(2)生物搖床搖動，將培養(yǎng)板置于普通生物搖床上(WD-9405D，北京六一生物科技有限公司)，在水平面做橢圓形運動，30～40 r/min，搖動約1 min后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)“十”字交叉搖動方式，根據(jù)培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿大小不同，采用兩種不同的搖動手法，使細胞懸液呈“十”字軌跡運動。針對面積小的12孔板，在水平面做前后、左右方向“十”字運動，先左右運動10個來回，再在垂直方向10個來回，依此交替，時間約1 min，針對面積較大的100 mm培養(yǎng)板，分別以水平面X軸和Y軸為樞紐，進行前后、左右的“蹺蹺板”式搖動，使液體呈垂直交叉運動，每個方向來回搖動10次左右，并交替進行，時間約1 min。

2 結(jié)果

不規(guī)則、橢圓形及“十”字軌跡搖動方式對細胞分布的影響如下：

(1)不規(guī)則搖動：研究發(fā)現(xiàn)，將A375細胞懸液種于12孔板后，進行簡單的不規(guī)則搖動，然后置于培養(yǎng)箱中，可見細胞分布明顯不均勻，中間區(qū)域細胞密集，甚至重疊，出現(xiàn)細胞因營養(yǎng)不足脫落死亡；而周邊區(qū)域細胞分布較稀疏，雖營養(yǎng)充足但細胞相互交聯(lián)少出現(xiàn)輪廓不清，生長速度緩慢等不良狀態(tài)(圖1A～1C)。

(2)橢圓形搖動：將含細胞懸液的12孔板用生物搖床在水平面上進行橢圓形搖動后，再進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其細胞分布相對于不規(guī)則搖動更加均勻，但培養(yǎng)孔中央?yún)^(qū)域仍有一定的細胞聚集區(qū)，亦使集聚區(qū)細胞脫落死亡(圖1D～1F)。

(3)“十”字軌跡搖動：根據(jù)培養(yǎng)板、皿的大小不同，我們采用了不同的搖動方式，使培養(yǎng)懸液呈“十”字交叉運動。對于直徑小于或等于60 mm的培養(yǎng)皿，或普通細胞培養(yǎng)板(6孔板、12孔板)等，可采用水平面的“十”字軌跡運動方式，即細胞種板后，用手工操作對培養(yǎng)皿/板進行水平面的“十”字軌跡運動，交替在前后和左右方向進行來回運動(圖1G，H)，然后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。本研究以12孔板為例進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與不規(guī)則搖動和橢圓形搖動方式相比，“十”字軌跡運動可使細胞分布更加均勻(見圖I)。而對于直徑大于100 mm的培養(yǎng)皿，水平面的“十”字軌跡運動容易使液體溢出，為此，我們用了“蹺蹺板”式的“十”字搖動方式，即以手工方式將培養(yǎng)皿分別以X軸和Y軸為支點，進行前后、左右搖動(圖J，K)，這種運動方式相對溫和，液體不容易溢出。我們用100 mm培養(yǎng)皿進行了測試，發(fā)現(xiàn)種板后細胞分布均勻，細胞輪廓清晰，效果與水平面的“十”字軌跡運動類似(圖L)。

3 討論

在貼壁細胞傳代培養(yǎng)過程中，不僅需要將細胞重懸并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板、皿或瓶中(簡稱為種板)，還需搖動生長液使細胞均勻分布。細胞貼壁后如分布不均勻，會對后續(xù)實驗造成困擾。如果細胞分布不均勻，會造成細胞在培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)成分多寡不同，且繁殖速度也不一樣。種板太密的地方，細胞獲取營養(yǎng)成分困難，并出現(xiàn)接觸抑制，從而限制了生長；細胞太稀的地方，因細胞之間“交流”減少，生長速度也可能減慢；而密度適中的地方，細胞狀態(tài)和生長速度均較佳，且均一性好。參差不齊的細胞密度和生長方式，對后續(xù)實驗影響較大，因此，如何使細胞分布均勻，是不少實驗工作者經(jīng)常遇到的難題。

圖1 不同搖動方式對細胞分布的影響細胞分布的影響

為了使細胞均勻分布，許多科研工作者用手工搖動的方式混勻細胞懸液，但操作方式因人而異，效果良莠不齊，究竟哪種搖動方式比較好，尚未見報道。有些實驗室則使用生物搖床對種板的細胞進行混勻，搖床的運動方式大多為水平橢圓形、圓周式搖動、左右擺動或不規(guī)則震動等，形狀大小功率等參數(shù)各不相同，某些搖床雖然可用于混勻細胞懸液，但參數(shù)不容易掌握，且效果不大穩(wěn)定。目前專業(yè)用于細胞種板的搖床很少見，更多的搖床是用于懸浮細胞的培養(yǎng)和震蕩[6]。

本實驗表明，不規(guī)則搖動容易使細胞出現(xiàn)分布不均，密集區(qū)域細胞因營養(yǎng)不足，生長空間受限，出現(xiàn)細胞死亡脫落，而稀疏區(qū)域細胞雖營養(yǎng)空間充足，但因缺乏細胞間相互作用而出現(xiàn)生長緩慢等表現(xiàn)；而橢圓形搖動種板細胞生長情況較不搖動方式好，其產(chǎn)生的分布密度差異相對較小，但仍有部分細胞分布不均勻。相較于前面兩種方式，“十”字軌跡運動可發(fā)揮有效混勻細胞的作用，培養(yǎng)后細胞分布均勻，形態(tài)輪廓清晰，生長狀態(tài)良好。

針對不同大小的培養(yǎng)皿/板，采用了不同的“十”字搖動方式。其中水平面“十”字軌跡搖動方式使用較多，這種運動方式的作用力較大，液體移動速度也較快，適合于直徑較小的培養(yǎng)板/皿，如6孔板、12孔板及35 mm、60 mm培養(yǎng)皿等，因這些規(guī)格的培養(yǎng)板/皿，培養(yǎng)面積小，液體移動距離短，故需要較大的搖動力度。但對于直徑較大的培養(yǎng)皿，如100 mm及以上培養(yǎng)皿，其液體可運動的距離遠，作用力也相對增大，此時再用水平面“十”字運動方式可造成液體飛濺逸出。因此，選用了較溫和的“蹺蹺板”式“十”字運動，這種方式是以X軸和Y軸為支點，前后、左右交替搖動培養(yǎng)皿，其混勻效果好，同時又不至使液體濺出。

生物搖床經(jīng)常用于混勻溶液或細胞等，搖床的機械運動可通過橫縱向搖桿、懸臂、萬向定位滑輪和電生磁場發(fā)生振蕩等多種方式實現(xiàn)各種運動，但目前市面鮮見專用于細胞培養(yǎng)，使生長液呈“十”字軌跡運動的搖床。本文為進一步開發(fā)相關(guān)的細胞培養(yǎng)專用搖床提供了依據(jù)。當然，要讓“十”字軌跡運動搖床適用不同的培養(yǎng)皿、板或瓶，還需要進行大量的實驗研究，才能得出頻率、振幅和時間等科學有效的數(shù)字化參數(shù)。