張業(yè)輝，楊 春，郭向華，鐘志國，李雪鵬*（. 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東東莞 53808；. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 5400）

近年來，全球痛風(fēng)發(fā)病率明顯增加且發(fā)病年齡呈低齡化趨勢。秋水仙堿、非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等西藥治療能有效地緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀,但不降低患者的血尿酸水平，且不良反應(yīng)多；而中藥治療痛風(fēng)則有較好的療效，且不良反應(yīng)發(fā)生率低[1-2]。民間中藥痛風(fēng)驗方治愈了大量痛風(fēng)患者[3]。本研究對此方進行動物實驗，以揭示其治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎機理，為后期中藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用健康雄性SD大鼠60只，無特定病原體動物(SPF)，實驗初始身體質(zhì)量(200±10)g，由廣東醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗藥物 痛風(fēng)驗方：白刺花根100 g 、八角楓根2 g、威靈仙35 g、卷柏15 g、當(dāng)歸15 g，上述藥物到正規(guī)中藥店購買。

1.1.3 實驗試劑 尿酸鈉，上海賽岳生物科技有限公司生產(chǎn)；秋水仙堿片，西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；IL-1βELISA 檢測試劑盒，鄭州博泰生物有限責(zé)任公司生產(chǎn)

1.1.4 實驗儀器 GANGTUO TOOL數(shù)顯游標(biāo)卡尺、組織勻漿儀、磁力攪拌器、PH 計、蒸餾水機、低溫高速離心機、超低溫冰箱、制冰機、電子天平、脫水機、超凈工作臺等由廣東醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 選用60只健康雄性SD大鼠，用隨機分組法分組，將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、秋水仙堿組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。

1.2.2 實驗藥物制備 (1)痛風(fēng)驗方的制備：將痛風(fēng)驗方藥物334 g紗布包好放入陶罐，加冷水6 000 mL浸泡1 h后，加土雞肉1 000 g大火煮開后，小火煮至雞肉熟后10 min，去除藥渣，將雞肉用攪拌機攪成肉末后和藥汁混合，將藥置于60 ℃水浴中濃縮成含生藥 0.5、1、2 g/mL 3種藥液，密封，放在 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)秋水仙堿液的制備：將秋水仙堿片0.5 mg/片，20片放入研缽內(nèi)研成細末，溶解于100 mL蒸餾水中，充分混勻，制備成質(zhì)量濃度為 0.1 g/L的秋水仙堿混懸液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?3)尿酸鈉溶液的制備：取500 mg尿酸鈉晶體(MSU) 加入0.9%氯化鈉注射液20 mL，攪拌制成質(zhì)量濃度為25 g/L的尿酸鈉溶液。超聲振蕩混勻。

1.2.3 造模 參照改良后的大鼠動物模型造模方法造模[4]。乙醚麻醉大鼠后以右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的關(guān)節(jié)腔為進針點，將踝關(guān)節(jié)擺放成直角，充分暴露踝關(guān)節(jié)與脛腓骨的間隙，注射針頭與脛骨成 45°夾角插入關(guān)節(jié)腔，各組注射25 g/L MSU晶體混懸液0.2 mL?？瞻捉M用等體積生理鹽水溶液關(guān)節(jié)腔注射。造模后 2 h大鼠活動減少，煩躁不安，進食進水次數(shù)減少，右側(cè)踝關(guān)節(jié)明顯充血腫脹，并伴隨紅、熱表現(xiàn)，有的甚至將右足抬離地面，證實造模成功。

1.2.4 動物給藥 秋水仙堿組造模后給予秋水仙堿每次l mL/200 g灌胃，低劑量組以200 g大鼠每次0.5 g/mL灌胃，中劑量組以每次以1 g/mL灌胃，高劑量組每次以2 g/mL灌胃，每天1次，連用5 d，空白組與模型組每次給予l mL/200 g生理鹽水灌胃。

1.2.5 觀測指標(biāo)和方法 (1)關(guān)節(jié)腫脹的觀察：觀察大鼠右下肢腫脹情況。每只大鼠均在造模前、造模后1 d、處死前測量右后肢踝關(guān)節(jié)周徑：用 2～3 mm寬紙條和數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)下 0.5 mm 處的周徑值。(2)細胞因子的測定：在給藥5 d后將大鼠處死，將大鼠右下肢踝關(guān)節(jié)以下剝離。在冰上取各組大鼠試驗足的踝關(guān)節(jié)組織并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP離心管中，剪開關(guān)節(jié)腔，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液0.5 mL稀釋，低溫超聲15 min后于3 000 r/min低溫離心10 min，將離心后所得上清液用ELISA試劑盒檢測測定IL-1β。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，以x±s表示數(shù)據(jù)，大鼠關(guān)節(jié)周徑采用重復(fù)數(shù)據(jù)方差分析，關(guān)節(jié)液中IL-1β濃度比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠踝關(guān)節(jié)周徑

造模前各組大鼠之間踝關(guān)節(jié)周徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。除空白組外，其余各組造模后1 d的大鼠踝關(guān)節(jié)周徑比造模前明顯增大(P<0.05)，空白組和其他各組比較踝關(guān)節(jié)周徑差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后第6天，各藥物治療組的大鼠踝關(guān)節(jié)周徑均明顯小于模型組(P<0.05)，空白組與各藥物治療組之間，以及秋水仙堿組與高、中、低劑量組各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠踝關(guān)節(jié)周徑 (±s，mm，n=10)

表1 大鼠踝關(guān)節(jié)周徑 (±s，mm，n=10)

與同組造模前比較：aP<0.05；與同期空白組比較：bP<0.05；與同期模型組比較：cP<0.05

造模后6 d組別空白組模型組秋水仙堿組低劑量組中劑量組高劑量組造模前25.42±0.389 25.85±0.326 25.44±0.580 25.43±0.613 25.45±0.534 25.51±0.561造模后1 d 26.81±0.394c36.06±0.353ab25.56±0.404 30.13±0.310 35.87±0.438ab26.56±0.564c35.86±0.422ab26.85±0.546c35.83±0.357ab26.75±0.483c36.23±0.224ab26.58±0.526c

2.2 IL-1β含量

模型組關(guān)節(jié)液中的細胞炎性因子IL-1β水平最高(P<0.01)，各藥物治療組的IL-1β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均高于空白組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠踝關(guān)節(jié)液中IL-1β水平 (±s，ng/L)

表2 大鼠踝關(guān)節(jié)液中IL-1β水平 (±s，ng/L)

與模型組比較：aP<0.01；與空白組比較：bP<0.05

n IL-1β組別空白組模型組秋水仙堿組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 10 10 0.535±0.482a14.655±1.033b1.331±0.171ab1.350±0.168ab1.264±0.200ab1.130±0.248ab

3 討論

迄今為止，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(AGA)的機制為：各種原因?qū)е碌难心蛩嵩龈撸⑹鼓蛩猁}在肌肉、關(guān)節(jié)及內(nèi)臟器官，尤其是泌尿系統(tǒng)沉積。這種沉積取決于血尿酸濃度、機體局部溫度、組織的pH值、局部組織的炎性狀態(tài)及其他離子的濃度水平等多因素。其沉積形成的MSU具有強烈的致炎性，可進一步導(dǎo)致巨噬細胞活化，滑膜細胞炎性反應(yīng)，進而產(chǎn)生大量的細胞因子。大量的細胞因子進一步導(dǎo)致滑膜細胞的炎性反應(yīng)，造成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。這類炎性因子導(dǎo)致滑膜組織中大量吞噬細胞活化，滑膜中可以檢測到激活的固有免疫細胞，滑液中大量炎性反應(yīng)因子聚集，包括IL-1β、IL-6、IL-18、IL-8(CXCL8)等[5-6]。目前研究顯示，其中IL-1β對組織細胞的炎性刺激最為強烈，由此進一步觸發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫，進而導(dǎo)致局部關(guān)節(jié)滑膜炎和全身反應(yīng)[1,7]。

本實驗采用隨機分組，設(shè)置空白組對照，通過參照改良的造模方法[4]，成功制造了急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的大鼠模型，通過對中藥治療組(高、中、低劑量)與模型組、空白組統(tǒng)計學(xué)分析比較，中藥組均能顯著降低關(guān)節(jié)液內(nèi)IL-1β的含量，大鼠腫脹的關(guān)節(jié)周徑明顯改善，和秋水仙堿的療效接近。白細胞介素(IL-1β)作為前炎癥網(wǎng)鏈中的一級細胞因子，不僅能夠加速炎癥進展，釋放炎癥物質(zhì)如前列腺素、白三烯和氧自由基等，而且可以促進膠原酶和其他中性蛋白酶的產(chǎn)生，造成軟骨基質(zhì)崩解、軟骨吸收和骨破壞等嚴(yán)重后果，對于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程起到重要作用[2]。民間中藥痛風(fēng)驗方臨床療效確切，其通過抑制關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性介質(zhì)IL-1β產(chǎn)生，避免關(guān)節(jié)局部進一步炎性病變而導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹疼痛。

西醫(yī)的AGA屬于中醫(yī)“痹癥、歷節(jié)風(fēng)、腳氣”的范疇，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者認為痛風(fēng)的病因責(zé)之內(nèi)、外二因。內(nèi)因或是先天稟賦不足，或是嗜食膏粱厚味，或是素體熱盛等。先天稟賦不足，則易致肝腎虧虛，嗜食肥甘厚膩，久之脾失健運，濕熱內(nèi)蘊；外因則為感受風(fēng)、寒、濕、熱等邪氣，侵襲經(jīng)絡(luò)。內(nèi)外合邪，致氣血運行不暢，痰濕客于肌肉筋骨之間，郁而化熱，則臨床證見關(guān)節(jié)局部紅腫熱痛，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙。急性期患者可見關(guān)節(jié)紅腫熱痛，多由寒濕郁熱化毒、濕熱、痰癖、濁毒為主，治療以清熱解毒、利濕化痰、活血化瘀為主[8]。本方白刺花根為君藥有清熱解毒，利濕消腫，涼血止血之功效，威靈仙有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)的作用，卷柏能活血通經(jīng)，當(dāng)歸補血和血，調(diào)經(jīng)止痛，八角楓根祛風(fēng)除濕，舒筋活絡(luò)，散瘀止痛，諸藥合用共同發(fā)揮清熱解毒、利濕化痰、活血化瘀止痛之效。中醫(yī)認為，雞肉味甘，性微溫。能溫中補脾，益氣養(yǎng)血，補腎益精，提高人體正氣。本實驗為該方臨床治療AGA提供了理論支撐，也為進一步尋找其有效成分提供了基礎(chǔ)。

本實驗也存在一些不足：既往研究表明，尿酸鈉晶體可通過多種途徑刺激IL-1p分泌，進而參與痛風(fēng)的發(fā)病[11]。但這種以尿酸鈉晶體為致病信號的理論無法解釋部分高尿酸血癥終身不發(fā)展為痛風(fēng)的現(xiàn)象，提示痛風(fēng)發(fā)病還有其他信號通路的參與。隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)的進展，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)作為自身免疫性炎性疾病，關(guān)節(jié)滑膜炎癥因子及其組成的滑膜免疫微環(huán)境在其發(fā)病過程中占有重要地位，它們可通過多個信號通路介導(dǎo)痛風(fēng)的發(fā)病。明確尿酸鈉晶體如何與免疫細胞相互作用參與痛風(fēng)的發(fā)病，將為AGA發(fā)病機制的研究開通新的渠道，也為痛風(fēng)的炎癥干預(yù)提供新的思路和切入點。