耿 婷,張曉紅,南 瓊

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科和消化疾病研究所,昆明 650000)

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病僅次于肺癌、和乳腺癌的最常見的癌癥,是第四常見的癌癥死亡原因,每年約有70 萬人死亡[1]。 自1988 年Vogelstein對(duì)正常組織-腺瘤-癌組織的發(fā)展過程進(jìn)行詳細(xì)解析[2],我們認(rèn)識(shí)到大多數(shù)結(jié)直腸癌的發(fā)展是從腺瘤到腺癌的過程,通常需要7 ～10 年,早期診斷并進(jìn)行干預(yù)的患者往往預(yù)后較好。 但結(jié)直腸癌是一種“沉默”性疾病,許多人直到癌癥轉(zhuǎn)移后才會(huì)出現(xiàn)下消化道出血或腹痛等臨床表現(xiàn)[3],因此早期診斷較困難。 目前篩查早期結(jié)直腸癌的常用方法有糞便潛血試驗(yàn)、糞便免疫組化檢測(cè)、全結(jié)腸鏡檢查等。 前兩者特異性較差,自發(fā)腸道出血可導(dǎo)致結(jié)果假陽性,另外癌早期出血較少,容易漏診。 而全結(jié)腸鏡檢查雖然在發(fā)現(xiàn)早期癌和癌前病變有高度敏感性,檢查同時(shí)就可以切除早期病灶,但侵入性較高,易引起患者不適,還需要復(fù)雜的腸道準(zhǔn)備,僅有少數(shù)國家直接采用結(jié)腸鏡檢查作為篩查手段[4]。 而在未接受篩查的人群中,約有60%～70%的結(jié)直腸癌病例是在晚期確診的[5]。 晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者尚缺乏有效可靠的治療手段。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶向藥物(如西妥昔單抗、帕尼單抗等)的出現(xiàn)豐富和發(fā)展了結(jié)直腸癌的治療。 但是RAS 基因是否突變以及突變的類型對(duì)EGFR 靶向藥物的治療效果有很大的影響,因此,使用EGFR 靶向藥物之前應(yīng)該對(duì)RAS基因(主要是KRAS 基因)進(jìn)行突變檢測(cè)[6]。 目前KRAS 突變?cè)囼?yàn)已被亞洲臨床指南認(rèn)可[7]。 近年來對(duì)外泌體的大量研究使得我們思考是否能通過其進(jìn)行無創(chuàng)簡便的方法來確定患者是否存在KRAS 突變,從而更好的指導(dǎo)EGFR 靶向治療藥物的臨床使用。

1 EGFR 在結(jié)直腸癌中的作用

EGFR 也稱為ErbB-1 或HER1,為大小為170×103的單體糖蛋白,表達(dá)于大多數(shù)組織中,是一種屬于細(xì)胞膜受體ErbB 家族的跨膜酪氨酸激酶受體。EGFR 級(jí)聯(lián)啟動(dòng)具有促進(jìn)二聚化的配體結(jié)合受體,導(dǎo)致酪氨酸激酶殘基自磷酸化,從而誘導(dǎo)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(主要是通過Ras /Raf /MEK/ERK/MAPK 和PI3K/AKT/mTOR 這兩條通路將信號(hào)從胞質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞核)的激活(圖1),導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄因子的激活,在包括轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌在內(nèi)的幾種不同的人類癌癥中發(fā)揮著調(diào)節(jié)增殖、分化、遷移、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的作用[8]。 研究表明大約60%～80%的結(jié)直腸癌患者存在EGFR 過表達(dá)[9-10]。

2 抗EGFR 單抗

目前最常用來治療晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的EGFR 靶向藥物主要是抗EGFR 單克隆抗體[11]。 以第一個(gè)于2004 年被美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療臨床上對(duì)化療耐受的晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的抗EGFR 單克隆抗體-西妥昔單抗為例：西妥昔單抗經(jīng)歷了廣泛的臨床前期和臨床評(píng)估,在許多細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了其抗腫瘤、抗增殖和細(xì)胞毒性作用[12]。 Cunningham 等[13]于2004 年在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了著名的BOND臨床試驗(yàn)的研究結(jié)果確立了西妥昔單抗在治療化療耐藥的晚期結(jié)直腸癌二線的地位。 西妥昔單抗通過與EGFR 的結(jié)合(圖1)阻止細(xì)胞內(nèi)配體介導(dǎo)的酪氨酸激酶磷酸化,導(dǎo)致下游信號(hào)通路的抑制,從而發(fā)揮其藥理作用[14]。 然而,抗EGFR 單克隆抗體價(jià)格昂貴,且臨床用藥后發(fā)現(xiàn)在一些患者身上療效并不十分理想,或是開始治療有效,而在治療過程中逐漸表現(xiàn)出耐藥性。 所以探索其耐藥機(jī)制,尋求有效方法指導(dǎo)靶向藥物的使用顯得尤為重要。

3 KRAS 突變

雖然導(dǎo)致西妥昔單抗耐藥性的原因有多種,但對(duì)耐藥結(jié)直腸癌患者的腫瘤標(biāo)本大規(guī)模分析結(jié)果顯示,40%存在KRAS 突變,且相較于其他的突變?nèi)鏟IK3CA 突變(占14.5%),BRAF 突變(占4.7%),NRAS 突變(占2.6%)等明顯占有比例優(yōu)勢(shì),更值得關(guān)注[15]。 KRAS 作為RAS 基因家族中的一員,是Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 這條信號(hào)通路中主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一。 所以KRAS 突變可繞過EGFR直接激活下游信號(hào),介導(dǎo)Ras/Raf/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子,使腫瘤細(xì)胞逃避西妥昔單抗的作用, 從而形成對(duì)西妥昔單抗的原發(fā)性耐藥。 越來越多的研究也表明比起突變型的患者,KRAS 野生型的患者對(duì)西妥昔單抗的敏感性較高,療效更顯著[16-18]。 同時(shí)西妥昔單抗治療過程中KRAS 的后續(xù)突變也會(huì)使患者對(duì)其反應(yīng)性下降,影響治療效果[19]。 所以在使用西妥昔單抗前以及治療過程中進(jìn)行KRAS 突變檢測(cè)十分有必要。 目前檢測(cè)結(jié)直腸癌KRAS 突變的方法主要是利用患者組織進(jìn)行DNA提取,而組織標(biāo)本主要來源于手術(shù)、結(jié)腸鏡或穿刺活檢,這些檢查因其侵入性帶來的傷害,并不是每個(gè)患者都能接受。

4 外泌體

4.1 外泌體概述

圖1 EGFR 信號(hào)通路及抗EGFR 單抗作用機(jī)制Figure 1 EGFR signaling pathway and the mechanism of anti-EGFR monoclonal antibody

雖然目前來說組織活檢仍是診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn),但其對(duì)患者的創(chuàng)傷性大,在需要?jiǎng)討B(tài)觀察病情的患者身上無法重復(fù)進(jìn)行。 為了彌補(bǔ)這一不足,液體活檢已發(fā)展成為一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域。 液體活檢是指收集患者的外周血來檢測(cè)患者血液的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumour cells,CTCs)、含有循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)的癌癥患者血液中的循環(huán)無細(xì)胞DNA(circulating cellfree DNA,cfDNA)、循環(huán)無細(xì)胞RNA(circulating cellfree RNA,cfRNA)以及循環(huán)細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),如外泌體和腫瘤“教育”的血小板(tumour-educated platelets,TEPs)、蛋白質(zhì)、代謝物等方法的總稱[20]。 最近,一項(xiàng)meta 分析明確指出cfDNA 十分有潛力作為判斷CRC 患者KRAS 突變的生物標(biāo)志物[21]。 而外泌體可以反映原始細(xì)胞的狀態(tài)、具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)保護(hù),內(nèi)容物不易降解、能穩(wěn)定存在于在各種血液、尿液和細(xì)胞培養(yǎng)基等液體中[22],更有可能將液體活檢運(yùn)用于臨床實(shí)踐中去。

外泌體是一種大小約30 ～100 nm 的膜性小囊泡,由肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞釋放,存在于包括血液、尿液等多種體液中[23]。 最早于上世紀(jì)80 年代由Johnstome 等人在培養(yǎng)羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)[24]。 隨著研究的不斷深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)外泌體因其內(nèi)部包裹的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA、microRNAs 等內(nèi)容物,可作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞的關(guān)鍵分子[25-30]。

4.2 外泌體檢測(cè)的發(fā)展

有研究報(bào)道,與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞分泌更多的外泌體[31]。 目前的研究著力于驗(yàn)證血清外泌體是否可作為一種新穎的,有潛力的生物標(biāo)志物來早期診斷癌癥和明確癌癥相關(guān)突變是否可以從患者血清外泌體中的mRNA 擴(kuò)增出來。 2010 年有研究指出,胃癌患者分泌的外泌體明顯高于正常對(duì)照組,且在對(duì)照組和胃癌患者的外泌體中都能檢測(cè)到如HER-2 等標(biāo)志物,但胃癌患者外泌體內(nèi)這些標(biāo)志物明顯高表達(dá)[32]。 2014 年有研究指出,鼻咽癌患者血漿中可連續(xù)檢測(cè)到癌外泌體且血清外泌體濃度的升高與患者終末期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)[33]。 2015 年有研究指出,外泌體可作為早期肺癌的潛在有效的生物標(biāo)志物[34]。 2016 年有研究指出,帕金森病患者尿液外泌體內(nèi)的富含亮氨酸的重復(fù)激酶2(LRRK2)可作為一種標(biāo)志物,與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[35]。 尤其是2016 年1 月21日,世界上第一個(gè)基于外泌體的癌癥診斷產(chǎn)品在美國上市,外泌體作為診斷標(biāo)志物的研究前進(jìn)了一大步[36]。 總之,對(duì)于外泌體作為診斷標(biāo)志物的研究層出不窮,研究者們也正在不斷努力地尋求更好的方法將其運(yùn)用到臨床實(shí)踐中去。

4.3 外泌體檢測(cè)與KRAS 突變

結(jié)直腸癌細(xì)胞KRAS 突變后會(huì)釋放更多的外泌體,且包含的蛋白質(zhì)組成改變,這些外泌體攜帶的蛋白轉(zhuǎn)移到周圍的KRAS 野生型細(xì)胞會(huì)明顯刺激其生長[37],這表明外泌體內(nèi)容物中存在能提示結(jié)直腸癌細(xì)胞KRAS 突變的成分。 有研究顯示KRAS 突變率在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和相匹配的血清外泌體中分別為57.6%和42.4%,沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.063),血清外泌體可用于結(jié)直腸癌患者的快速非侵入性基因分型檢測(cè)。 該研究還指出與cfDNA相比,外泌體攜帶的基因片斷更加豐富且穩(wěn)定性更好[38]。 國內(nèi)也有研究指出外泌體DNA 突變檢測(cè)較組織學(xué)檢測(cè)靈敏度為90.6%,一致性為81.1%。 且外泌體檢測(cè)反映的是患者的整體狀況,并不局限于原發(fā)灶的突變,有效避免了腫瘤異質(zhì)性對(duì)檢查結(jié)果的影響[39]。 通過對(duì)結(jié)直腸患者外泌體DNA 突變頻率的連續(xù)監(jiān)測(cè)也發(fā)現(xiàn)突變頻率與西妥昔單抗的療效具有相關(guān)性,即當(dāng)西妥昔單抗治療效果好時(shí),患者KRAS 突變頻率較低,而當(dāng)患者對(duì)西妥昔單抗逐漸出現(xiàn)耐藥時(shí),基因突變的頻率則出現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)[19]。 這進(jìn)一步說明了外泌體中KRAS 突變情況與西妥昔單抗耐藥性有很好的一致性。

4.4 外泌體的分離純化

目前外泌體的提取分離方法主要有超速離心法、順序?yàn)V過法、尺寸排阻色譜法、磁珠特異性捕獲法、聚合物沉淀法等。

超速離心一般和蔗糖密度梯度離心或蔗糖襯墊組合起來分離低豐度外泌體,操作簡便,可以獲得高純度的外泌體,是分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)。 但重復(fù)離心可能對(duì)外泌體的囊泡造成損害從而降低其質(zhì)量,可溶性蛋白與外泌體形成團(tuán)塊也會(huì)導(dǎo)致外泌體污染[40]。 順序過濾法是利用不同空隙的超濾膜對(duì)樣品中不同大小的分子進(jìn)行分離,此方法簡單高效,但外泌體可能會(huì)堵塞濾孔,導(dǎo)致膜的壽命縮短,分離效率較低[41]。 尺寸排阻色譜法也是利用大小來分離外泌體,可以極大保留外泌體的完整性和生物活性,與差速離心法結(jié)合可獲得高度純化的外泌體[42]。 外泌體表面有特異性標(biāo)記物,磁珠特異性捕獲的方法是利用抗體與標(biāo)記物的特異性結(jié)合,將抗體固定在磁珠表面可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的特異性富集,此法特異性強(qiáng),但價(jià)格昂貴[43]。 聚合物沉淀法是使用不同體積的含有沉淀物的溶液和生物體液混合,對(duì)來自樣品的外泌體進(jìn)行沉淀,目前這類方法市場(chǎng)上已經(jīng)有比較成熟的試劑盒如ExoQuickTM,但使用聚合物沉淀溶液會(huì)產(chǎn)生非外泌體組分的共沉淀,難以洗脫的沉淀劑會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行[44]。 這些方法各有利弊,研究者多根據(jù)自己需求和經(jīng)濟(jì)水平加以選擇,也可以多種方法聯(lián)合運(yùn)用。 最近,Zhang 等[45]還提出了他們研究的微流體裝置能檢測(cè)出微升存在的外泌體并證實(shí)了外泌體是卵巢癌的潛在生物標(biāo)志物。

5 結(jié)語

綜上所述,為了使晚期結(jié)直腸癌患者能得到更為精準(zhǔn)的治療,在使用抗EGFR 單抗治療時(shí)檢測(cè)KRAS 突變十分有必要。 而外泌體在腫瘤檢測(cè)中表現(xiàn)出了強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿?且在結(jié)直腸癌中檢測(cè)KRAS突變時(shí)外泌體檢測(cè)除了與組織檢測(cè)體現(xiàn)出較好的一致性外,還具有非侵入、可重復(fù)、能在治療過程中檢測(cè)KRAS 的變化情況等優(yōu)點(diǎn)。 外泌體的分離純化方法也在不斷完善中。 因此外泌體有望成為臨床上檢測(cè)結(jié)直腸癌KRAS 突變的新手段。