董冰瑤 耿安琪 袁時芳 邢金良

作者單位：710032 西安 1空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院甲乳血管外科；2空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理與病理生理教研室

近年來，在全球范圍內(nèi)乳腺癌已經(jīng)取代肺癌成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康和生活質(zhì)量［1］。目前乳腺癌診斷及療效監(jiān)測手段主要包括組織活檢、影像學檢查及傳統(tǒng)的蛋白標志物檢測。組織活檢依靠手術(shù)醫(yī)師的侵入性操作，重復性差，而影像學檢查及傳統(tǒng)血液生物標志物檢測對乳腺癌小結(jié)節(jié)良惡性的判斷及治療療效評估的靈敏性及準確性均不高，因此亟待尋找新型標志物用于乳腺癌診療全過程。近年來，“液體活檢”逐漸成為精準腫瘤學的研究熱點［2］，其中循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）以其獨特優(yōu)勢在乳腺癌早期診斷、治療反應監(jiān)測、復發(fā)及轉(zhuǎn)移監(jiān)測等方面顯示出巨大的臨床應用前景，為個性化診治提供了新思路［3］。本文就ctDNA在乳腺癌臨床診治中的研究進展進行綜述。

1 ctDNA生物學特征

ctDNA是指經(jīng)腫瘤細胞凋亡壞死或主動分泌釋放到患者血液循環(huán)中的DNA片段，也是血液中含有腫瘤細胞基因組的直接證據(jù)［4］。在外周血中，ctDNA僅占總循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）的極少部分，平均每毫升血漿濃度僅為10～12 ng，片段長度為 130～150 bp［5-6］。UNDERHILL 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA與cfDNA的片段長度大小存在明顯差異，提示從cfDNA中分離特定長度的DNA片段或可提高ctDNA的檢測效率。另一項研究顯示ctDNA半衰期僅為30 min至2.5 h［8］，因此ctDNA分析成為能反映癌癥負擔的實時“快照”。ctDNA還攜帶原發(fā)性實體腫瘤來源的基因變異，能反映原發(fā)腫瘤不同區(qū)域腫瘤細胞所釋放DNA的基因組全貌［9］。此外，DE MATTOSARRVDA等［10］在1例肝轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，ctDNA經(jīng)靶向深度測序捕獲的FLP4及MAP2K2突變也存在于轉(zhuǎn)移灶中，但在原發(fā)腫瘤中未檢測到，說明ctDNA檢測可同時捕獲原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶中的全部突變。類似研究也證實ctDNA分析有助于全面評估腫瘤異質(zhì)性，實現(xiàn)對腫瘤細胞基因組多位點克隆進化的實時監(jiān)測［9］，對臨床診治方案決策及調(diào)整具有重要的指導意義?？傊?，ctDNA具有的以上特點，使其成為“液體活檢”中高度關(guān)注的靶標之一。

2 ctDNA與乳腺癌早期診斷

目前，關(guān)于ctDNA檢測用于早期乳腺癌篩查的數(shù)據(jù)有限，部分原因是早期疾病的低腫瘤負荷使ctDNA血液濃度極低，因此檢測困難?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者ctDNA濃度與早期乳腺癌腫瘤負荷有直接關(guān)聯(lián)。LEARY等［11］通過優(yōu)化ctDNA檢測分析方法，發(fā)現(xiàn)ctDNA在乳腺癌診斷中的敏感度、特異度分別為90%、99%，但該研究納入的樣本量較少，統(tǒng)計學上證據(jù)不足。也有學者報道ctDNA PIK3CA及TP53變異在乳腺鉬靶分級為BRADS-4c/5的乳腺癌篩查中發(fā)揮一定作用［12］。本團隊前期研究［13］發(fā)現(xiàn)HER2+乳腺癌患者ctDNA HER2拷貝數(shù)中位值為1.3（95%CI：1.2～1.36），高于健康對照組的 0.98（95%CI:0.95～1.03，P<0.01），提示ctDNA HER2拷貝數(shù)具有一定的診斷價值。此外，ctDNA甲基化水平對乳腺癌早期診斷也具有重要意義。SHAN等［14］將 SFN、P16、hMLH1、HOXD13、PCDHGB7、RASSF1a 6個基因作為乳腺癌ctDNA甲基化水平特定的篩選位點以區(qū)分健康者與乳腺癌患者，其特異度、靈敏度分別為78.1%、82.4%。另有研究聯(lián)合ctDNA拷貝數(shù)變異和基因變異與ctDNA甲基化水平、蛋白質(zhì)類生物標志物或其他腫瘤特異性標志物，然后通過特定的篩選算法用于早期乳腺癌診斷［15-17］。然而，目前ctDNA用于乳腺癌早期診斷的變異閾值仍缺乏統(tǒng)一標準，區(qū)分健康人群與腫瘤患者以及良性腫瘤與惡性腫瘤的效能存在較大差異。

3 ctDNA與乳腺癌分子分型

乳腺癌亞型依賴于癌細胞表面受體表達水平，最終由腫瘤細胞表面受體上游靶基因差異表達決定［18］。若ctDNA替代組織活檢用于乳腺癌分型，必須考慮的問題是ctDNA變異與原發(fā)腫瘤基因組變異是否有較高一致性以及ctDNA變異能否準確反映不同亞型的分子特征？針對這些問題，GUAN等［19］研究納入105例不同亞型乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)在抗腫瘤治療前HER2基因擴增在ctDNA與原發(fā)灶腫瘤組織中的一致率達86.5%，診斷HER2表型的陽性預測值為94.9%，證實ctDNA在乳腺癌分子分型診斷中的應用潛力。SHATSKY 等［20］在 TP53、PIK3CA 和 ESR1基因突變的乳腺癌以及RIVIERE等［21］在胃腸道惡性腫瘤研究中也獲得了類似的一致率。以上研究結(jié)果表明ctDNA變異與組織DNA變異的一致性較好，能夠較好地反映腫瘤組織DNA特征，有望替代組織活檢。然而，目前檢測流程中如樣本提取、儲存和檢測方法以及數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)仍缺乏統(tǒng)一標準，這在一定程度上限制了ctDNA檢測在臨床上的應用。CHAE等［22］利用兩種不同的第二代測序平臺（Foundation Medicine和Guardant360）對45例乳腺癌患者ctDNA和配對組織DNA進行測序分析，發(fā)現(xiàn)當考慮所有檢測基因時（包括未發(fā)生突變的基因），ctDNA變異與組織DNA變異的一致率為91.0%～94.2%，但當只考慮腫瘤相關(guān)基因時兩者的一致率僅為10.8%～13.8%，拷貝數(shù)變異的一致率更低，僅為3.5%，因此認為不同檢測技術(shù)及數(shù)據(jù)分析方法會導致結(jié)果出現(xiàn)較大差異。

盡管如此，目前也有越來越多的證據(jù)表明ctDNA檢測可用于區(qū)分乳腺癌的不同亞型。YI等［23］發(fā)現(xiàn)不同亞型的晚期乳腺癌患者ctDNA在基因變異方面具有明顯不同的特征：FGFR1基因拷貝數(shù)變異（CNV）及點突變、NOTCH3點突變和ESR1點突變只能在ER+組中被檢測到，且該組中PIK3CA突變頻率高于ER-組（40.00%vs 17.14%）；與 HER2+組相比，NOTCH1基因在HER2-組中的突變頻率更高（15.63%vs2.94%），而ERBB2基因CNV及點突變只在前者中被發(fā)現(xiàn)；且三陰型乳腺癌ctDNA中檢測出的癌癥相關(guān)基因數(shù)量在4種亞型中最多。ZHOU等［24］也發(fā)現(xiàn)不同亞型乳腺癌患者ctDNA的檢出率存在差異，HER2過表達與ctDNA中ERBB2基因擴增呈正相關(guān)，提示ctDNA中ERBB2基因擴增可能成為乳腺癌HER2+組與其他亞型區(qū)分的檢測靶標。以上研究說明，ctDNA變異在不同亞型之間的差異能為乳腺癌分子分型提供鑒別價值，未來有可能成為一種快捷高效、可重復的檢測手段。但目前相關(guān)研究仍較少，ctDNA與乳腺癌分子分型的相關(guān)性可作為下一步的研究方向。

4 ctDNA與乳腺癌新輔助治療療效的動態(tài)評估

近年來，越來越多的研究證實ctDNA可用于乳腺癌新輔助治療、內(nèi)分泌治療及靶向治療療效的動態(tài)監(jiān)測。一項哌柏西利和氟維司群用于治療晚期激素受體陽性乳腺癌患者的隨機Ⅲ期臨床試驗［25］發(fā)現(xiàn)，縱向分析基線、用藥第1天、第15天的ctDNA PIK3CA突變水平變化可預測患者治療后期對帕博西尼的敏感性，但ctDNA ESR1突變的動力學改變預測價值并不大。而ctDNA ESR1突變能否動態(tài)監(jiān)測內(nèi)分泌治療？LI等［26］研究則得出了不同的結(jié)論，該研究通過縱向分析每3個月1次的ctDNA ESR1突變水平，發(fā)現(xiàn)ctDNA ESR1突變的動態(tài)變化與血液腫瘤標志物（CA153、CA125、CA199）的變化趨勢及影像診斷結(jié)果（根據(jù)實體瘤療效評價標準評估疾病進展、疾病穩(wěn)定）的變化具有高度一致性，說明ctDNA ESR1突變能預測HR+乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的耐藥性。此外，該研究還觀察到不同類型的ESR1突變在治療過程中表現(xiàn)為依次獲得，這可能反映了腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性以及內(nèi)分泌治療壓力下ESR1突變的選擇性演變，也說明在內(nèi)分泌治療過程中ctDNA動力學改變能顯示出腫瘤亞克隆對治療的不同反應。

關(guān)于靶向治療方面，GUAN等［19］納入31例HER2陽性乳腺癌患者，對其靶向治療過程中的ctDNA HER2拷貝數(shù)進行動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)治療基線時HER2擴增水平與經(jīng)數(shù)個用藥周期后相比明顯降低，CT掃描檢查顯示疾病出現(xiàn)進展時，配對的ctDNA HER2拷貝數(shù)也明顯上升，可見ctDNA HER2擴增隨靶向治療效果波動，尤其治療6周后HER2擴增持續(xù)陽性者無進展生存期明顯減少。本團隊前期的一項研究［13］納入30例曲妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療的HER2陽性乳腺癌患者，動態(tài)監(jiān)測了患者的ctDNA HER2拷貝數(shù)，結(jié)果顯示治療前后HER2拷貝數(shù)明顯下降，且病理完全緩解與HER2拷貝數(shù)有關(guān)。RIVA等［27］納入38例接受新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NCT）的三陰型乳腺癌患者，縱向分析NCT前、第1周期前、手術(shù)前以及手術(shù)2～10周后4個時間點的ctDNA含量變化，發(fā)現(xiàn)ctDNA含量與NCT過程中的腫瘤負擔呈正相關(guān)，說明ctDNA在三陰型乳腺癌的NCT過程中對監(jiān)測其腫瘤進展具有一定潛力。

綜上可見，目前的研究顯示了ctDNA連續(xù)監(jiān)測在乳腺癌患者新輔助治療中的積極意義，但新輔助治療早期ctDNA變異或任何時間點的ctDNA變異能否預測腫瘤對藥物的反應及耐藥性仍需大樣本的前瞻性研究及長期臨床隨訪證實。

5 ctDNA與乳腺癌微小疾病殘留及不良預后

既往研究以證實微小疾病殘留（minimal residual disease，MRD）與乳腺癌復發(fā)和不良預后密切相關(guān)［28］?，F(xiàn)越來越多的研究也已證實ctDNA在早期發(fā)現(xiàn)MRD及評估預后的實用性。CIRMENA等［29］從治療基線開始，對10例乳腺癌患者的治療全過程進行了長達2年的多時間點連續(xù)跟蹤隨訪，并對ctDNA進行標記靶向深度測序（tTDS），證實了ctDNA追蹤在檢測MRD和預后評估中的潛在臨床價值。預測復發(fā)方面，GARCIA-MURILLAS等［30］開展的前瞻性隊列研究共納入55例接受NCT的早期乳腺癌患者，檢測術(shù)后早期（第2周及第4周）及每隔6個月采集點的ctDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ctDNA的靶向捕獲測序分析可確定是否存在MRD，從而較好地預測轉(zhuǎn)移性復發(fā)，且相較于臨床常用監(jiān)測方法其預測時間平均提前了7.9個月。OLSSON等［31］也報道ctDNA預測乳腺癌復發(fā)的時間平均提前了11個月，還發(fā)現(xiàn)術(shù)后ctDNA的檢出與較短的無病生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）有關(guān)。此外，多項研究也已證實ctDNA預測復發(fā)具有較高準確性［32-33］。然而，近年來盡管ctDNA捕獲及測序技術(shù)不斷優(yōu)化，但其特異性靶向捕獲探針的設(shè)計復雜，因此ctDNA檢測的靈敏性和特異性并不理想，從而限制了ctDNA在監(jiān)測MRD及預后評估等方面的應用。

6 小結(jié)

乳腺癌已進入分子分型指導下的個體化診療時代，與經(jīng)典的組織活檢和傳統(tǒng)的影像學方法相比，ctDNA檢測具有簡便、無創(chuàng)、實時動態(tài)、可重復性等優(yōu)點，能更全面、靈活、動態(tài)地反映腫瘤的演變過程。采用新一代測序技術(shù)進行ctDNA高通量檢測，并對檢測技術(shù)進行標準化后有望替代傳統(tǒng)的組織活檢，為乳腺癌的早期診斷、個體化治療、預后判定等提供簡便、特異、微創(chuàng)的檢測手段。同時也應該看到，盡管ctDNA檢測技術(shù)的迅速發(fā)展已經(jīng)極大地提高了ctDNA的檢測效率，但是各檢測環(huán)節(jié)的處理標準仍不規(guī)范，其臨床實用性也仍需大規(guī)模的基礎(chǔ)實驗和臨床研究證實，才能真正為乳腺癌患者的個體化精準診療提供服務(wù)。