畢歡歡，張曉雅，王小敏，劉玉衛(wèi)，鞏校東， 谷守芹，韓建民，董金皋

(1.河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001；2.泊頭職業(yè)學院，河北 泊頭 062150)

玉米大斑病(Northern corn leaf blight)是一種常見的玉米葉部病害，在我國的東北、華北北部以及南方冷涼山區(qū)常有發(fā)生[1]。引起該病害的病原菌為玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)。該病害直接影響玉米葉片的光合作用從而導(dǎo)致玉米減產(chǎn)，嚴重時減產(chǎn)可達50%[2-3]，目前在生產(chǎn)上種植抗病玉米品種是最重要的防控措施，但近年來由于該病菌變異頻繁，使得抗病玉米品種的抗性頻頻喪失[4]。因此，研發(fā)新型殺真菌制劑已成為目前研究的熱點之一。

研究表明，真菌細胞壁是由糖蛋白、葡聚糖和幾丁質(zhì)所構(gòu)成，其中幾丁質(zhì)在賦予細胞壁剛性、物理強度和特定形狀中發(fā)揮重要作用[5-6]。幾丁質(zhì)是由膜蛋白幾丁質(zhì)合成酶通過催化N-乙酰葡糖胺單體聚合形成[7]。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)了3個編碼幾丁質(zhì)合成酶的Scchs基因。Scchs1p在出芽過程中作為一種修復(fù)酶，修補酵母子細胞脫離母體后脆弱的細胞壁；Scchs2p參與初級隔膜的形成；Scchs3p參與芽痕和側(cè)壁的幾丁質(zhì)合成[8-9]。在禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中，F(xiàn)gChs2和其他的幾丁質(zhì)合成酶基因共同調(diào)控病菌的營養(yǎng)發(fā)育和毒力[10]。在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中，MoCHS1、MoCHS6和MoCHS7對于植物侵染是必需的，MoCHS5和MoCHS6在維持菌絲的極化生長過程中共同發(fā)揮作用[11]。另外，對釀酒酵母(S.cerevisiae)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、小巢狀麴菌(Aspergillusnidulans)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)和稻瘟病菌(M.oryzae)等真菌進行系統(tǒng)進化分析表明，這些真菌中的幾丁質(zhì)合成酶基因可為7類(Class Ⅰ～Class Ⅶ)[10]。河北省植物生理與分子病理學重點實驗室植物病原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)課題組前期研究中在玉米大斑病菌中已鑒定得到8個幾丁質(zhì)合成酶基因(StCHS1～StCHS8)，將這些幾丁質(zhì)合成酶基因同樣分為7類(Ⅰ～Ⅶ)，其中StCHS7屬于Class Ⅰ,StCHS8屬于Class Ⅱ,StCHS6屬于Class Ⅲ,StCHS2屬于Class Ⅳ,StCHS5屬于Class Ⅴ,StCHS1屬于Class Ⅵ，StCHS3、StCHS4屬于Class Ⅶ。

本研究擬從玉米大斑病菌中克隆其關(guān)鍵的幾丁質(zhì)合成酶基因StCHS6(Class Ⅲ)，并利用SMART、GSDS、Expasy、SOMPA和WoLF PSORT等軟件對其基因結(jié)構(gòu)及其所編碼的蛋白進行分析，進一步利用RNA-Seq技術(shù)分析StCHS6在病菌不同發(fā)育時期的表達模式，旨在明確玉米大斑病菌幾丁質(zhì)合酶基因StCHS6的結(jié)構(gòu)特征及表達模式，闡明該基因在病菌的生長發(fā)育及致病過程中的作用及研發(fā)以幾丁質(zhì)合成酶基因為靶標的新型抗真菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

玉米大斑病菌1號小種菌株01-23，由河北農(nóng)業(yè)大學河北省植物生理與分子病理學重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶及PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser均購于寶生物工程(大連)有限公司；便捷型植物RNA快速提取試劑盒購于天津華力科析科技有限公司；膠回收試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA的提取 玉米大斑病菌野生型菌株于25 ℃黑暗條件培養(yǎng)12 d后，收集病菌氣生菌絲。RNA提取方法參照便捷型植物RNA快速提取試劑盒說明書。

1.3.2 第一鏈cDNA的合成 以1.3.1提取的病菌總RNA為模板，參照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒使用說明書合成第一鏈cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 玉米大斑病菌StCHS6基因的克隆 對玉米大斑病菌中幾丁質(zhì)合成酶的鑒定結(jié)果表明，StCHS6的蛋白ID為133408。利用該蛋白ID于玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://genome.jgi.doe.gov/Settu1/Settu1.home.html)中下載StCHS6的CDS序列[12-13]。利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物CHS6-F/R用于StCHS6的CDS序列擴增(表1)。PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA(300 ng/μL) 1 μL，CHS6-F/R(10 μmol/L)各1 μL，TaKaRaTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進行檢測。

表1 基因克隆引物序列Tab.1 Primer sequences used in gene cloning

1.3.4StCHS6基因及編碼產(chǎn)物的生物信息學分析StCHS6基因的結(jié)構(gòu)特征及其所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析參考文獻[14]。

1.3.5 玉米大斑病菌不同發(fā)育時期材料的收集 病菌不同發(fā)育時期材料的收集方法參考文獻[14]。

1.3.6StCHS6在玉米大斑病菌不同發(fā)育時期的表達模式分析 基于已經(jīng)獲得的玉米大斑病菌RNA-Seq數(shù)據(jù)庫，分析StCHS6在病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘5個典型的發(fā)育時期的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌StCHS6基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析

利用StCHS6的蛋白ID從玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索，結(jié)果表明其位于病菌基因組scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置，基因全長為3 584 bp，CDS序列大小為2 703 bp。以玉米大斑病菌cDNA為模板，對StCHS6的CDS序列進行擴增，得到的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(圖1)。對目的條帶進行回收測序，擴增產(chǎn)物序列與數(shù)據(jù)庫所下載序列一致，表明在該病菌中克隆得到了StCHS6的CDS序列。

利用Gene Structure Display Server (GSDS)在線軟件對StCHS6的基因結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，StCHS6含有4個內(nèi)含子，5個外顯子(圖2)。內(nèi)含子相位通常用于分析基因結(jié)構(gòu)的進化，0、1和2代表內(nèi)含子在密碼子中的位置。0代表內(nèi)含子位于第1個堿基之前，1代表內(nèi)含子位于第1個堿基之后，2代表內(nèi)含子位于第2個堿基之后[15]。根據(jù)2個相鄰內(nèi)含子的組合是否引起移碼突變定義了兩類外顯子：不對稱外顯子和對稱外顯子[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，StCHS6基因不含有0相位，2個相鄰內(nèi)含子相位的組合分別為(1-2)，(2-2)和(2-1)，表明在StCHS6中不對稱外顯子和對稱外顯子均存在。

M.DNA Marker(100～5 000 bp); 1, 2.StCHS6基因擴增產(chǎn)物。 M.DNA Marker(100-5 000 bp); 1, 2.Amplification products of StCHS6.

圖2 StCHS6基因結(jié)構(gòu)特征Fig.2 The structure characteristics of StCHS6 gene

2.2 玉米大斑病菌StCHS6蛋白的理化性質(zhì)分析及亞細胞定位

利用Expasy在線軟件對StCHS6蛋白的理化性質(zhì)進行分析，推測StCHS6蛋白的分子式為C4586H6985N1203O1309S30，編碼900個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為100.877 98 ku，等電點(PI)為8.36，表明StCHS6蛋白為堿性蛋白。該蛋白的脂肪指數(shù)為81.86，親水性平均值為-0.178，不穩(wěn)定指數(shù)為36.94，屬于穩(wěn)定型蛋白。利用SOMPA對StCHS6蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明在該蛋白中，無規(guī)則卷曲(Random coil)占43.56%，α-螺旋(Alpha helix)占38.44%，延伸鏈(Extended strand)占13.44%，β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)占4.56%。利用SMART對StCHS6的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)StCHS6包含幾丁質(zhì)合酶催化結(jié)構(gòu)域Chitin_synth_1(682-694aa)和多個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。利用WoLF PSORT對該蛋白進行亞細胞定位分析，推測其位于細胞膜上。

藍色長方形代表跨膜結(jié)構(gòu)域；粉色長方形代表幾丁質(zhì)合酶催化結(jié)構(gòu)域Chitin_synth_1。 The blue rectangle represents transmembrane region; The pink rectangle represents the chitin synthase catalytic domain Chitin_synth_1.

2.3 StCHS6在玉米大斑病菌不同發(fā)育時期的表達模式

基于RNA-Seq數(shù)據(jù)對StCHS6在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞及侵入釘5個發(fā)育時期的表達模式進行分析。結(jié)果表明，StCHS6在以上5個發(fā)育時期均有表達，但其表達量有所差異(圖4)。以芽管時期的表達量為1，菌絲、分生孢子、附著胞和侵入釘時期的表達量分別為菌絲時期的3.80，4.97，3.40，2.60倍，說明StCHS6在分生孢子時期表達量最高，在芽管時期表達量最低。以上結(jié)果表明，StCHS6在玉米大斑病菌生長發(fā)育及侵染過程中均發(fā)揮作用，但在各個發(fā)育時期的重要程度有所不同。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。 Different small letters indicate significant difference at the 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

前人研究表明，真菌中的幾丁質(zhì)合成酶在維持細胞完整性、菌絲生長和寄主侵染等過程中均發(fā)揮重要作用[17-18]。在小巢狀麴菌(A.nidulans)中，Class Ⅲ的幾丁質(zhì)合成酶對于菌絲生長是必需的[19]；在禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中沒有獲得Fgchs3b(Class Ⅲ)的缺失突變體，表明該基因的缺失可能是致命的[20]；在稻瘟病菌(M.oryzae)中，Class Ⅲ中的幾丁質(zhì)合成酶的缺失會導(dǎo)致超過90%的分生孢子形態(tài)異常[11]；而在灰葡萄孢菌(B.cinerea)中，Class Ⅲ幾丁質(zhì)合成酶(Bcchs3a)的缺失導(dǎo)致病菌毒力顯著降低[21]；在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，Class Ⅲ類幾丁質(zhì)合成酶基因AnchsB在其整個發(fā)育過程中都表達，當AnchsB敲除后，出現(xiàn)了菌株生長速率減慢、不產(chǎn)孢子、菌絲尖端膨大和側(cè)壁異常等表型缺陷[22]。以上結(jié)果表明，真菌中ClassⅢ幾丁質(zhì)合成酶通過影響細胞壁的合成從而對病菌的生長發(fā)育及侵染和致病過程造成影響。本研究中，RNA-Seq數(shù)據(jù)表明StCHS6在病菌生長發(fā)育的各個時期都表達，但在菌絲和分生孢子時期表達量較高，由此推測，StCHS6可能參與玉米大斑病菌的菌絲生長及產(chǎn)孢過程，但需要進一步通過創(chuàng)制StCHS6基因敲除突變體進行驗證。

前人研究表明，幾丁質(zhì)是植物病原真菌細胞壁的特有組分，該物質(zhì)不存在于植物細胞壁中，因此，研發(fā)以抑制或干擾病原真菌幾丁質(zhì)合成酶合成或降低該酶活性的新型殺菌劑是目前植物病理學界研究的熱點之一[23]。本研究只是分析了玉米大斑病菌幾丁質(zhì)合成酶家族中的1個關(guān)鍵基因StCHS6的表達模式，尚沒有對整個基因家族的表達規(guī)律及功能進行系統(tǒng)分析。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)利用基因敲除和過表達技術(shù)，明確該基因在病菌致病性方面的功能，進一步通過比較突變體與野生型菌株對細胞壁類殺真菌制劑的敏感性，明確殺真菌制劑的作用機制，并篩選創(chuàng)制新型殺真菌制劑。

本研究通過克隆得到了玉米大斑病菌幾丁質(zhì)合成酶基因StCHS6的CDS序列，發(fā)現(xiàn)該基因含有4個內(nèi)含子，5個外顯子。對其所編碼的蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼900個氨基酸，屬于堿性穩(wěn)定型蛋白。該蛋白含有幾丁質(zhì)合成酶催化結(jié)構(gòu)域Ⅰ和多個跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于細胞膜上。對StCHS6在病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘時期的表達量分析表明，該基因在分生孢子時期表達量最高，在芽管時期表達量最低，說明StCHS6可能在分生孢子時期發(fā)揮重要作用。