王 凱，周露玙，劉 靖，王 濤，高向前，王 昆

心血管疾病日益危害人類的生命健康，在心血管疾病方面進(jìn)行生命科學(xué)基礎(chǔ)研究對人類社會的生存與發(fā)展都有著重大而深遠(yuǎn)的意義。2006年，多個實驗室先后發(fā)現(xiàn)一新型非編碼小RNA，這種RNA在生殖細(xì)胞中表達(dá)量較高，一般為25～35 nt，5′端首位通常為單磷酸的尿嘧啶核糖核酸，3′末端一般有甲基化修飾，與Piwi蛋白能結(jié)合形成復(fù)合體[1]，因此稱其為Piwi蛋白互作RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)。隨后piRNA逐漸成為非編碼RNA領(lǐng)域的研究熱點，研究者們在果蠅、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠等模式動物的研究中發(fā)現(xiàn)，piRNA在生殖細(xì)胞以及干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、種系DNA的完整性、生物性別決定、免疫防御及癌癥預(yù)測等方面都扮演著不可或缺的角色[2]。雖然非編碼RNA，尤其是piRNA在心血管疾病研究中還處于起步階段，但是從一些相關(guān)研究中可以窺探到piRNA潛在研究價值。作者對piRNA及其與心臟相關(guān)疾病的潛在調(diào)控關(guān)系作一綜述。

1 piRNA

1.1 piRNA的發(fā)現(xiàn) 20世紀(jì)90年代末，干擾RNA(RNA interference，RNAi)被發(fā)現(xiàn)，它讓人們對基因表達(dá)調(diào)控方式的理解產(chǎn)生巨大改變。這些非編碼RNA不會被翻譯成蛋白質(zhì)，而是通過與靶向RNA互補(bǔ)堿基的配對或與靶向蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用。根據(jù)它們加工機(jī)制或伴侶Argonaute蛋白的不同，這些小RNA可以分為miRNAs、小干擾RNA(small RNAs，siRNAs)和piRNAs。2006年，Aravin等[3]以3月齡C57小鼠為研究對象，從輸精管中分離得到一種小RNA，并發(fā)現(xiàn)此高表達(dá)小RNA與MILI(一種Piwi亞蛋白)存在相互作用，他們將其命名為piRNA。之后，在對piRNA生物合成的研究中發(fā)現(xiàn)，基因間區(qū)大量piRNA簇經(jīng)雙向或單向轉(zhuǎn)錄形成piRNA前體，再由內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生piRNA；此外，在mRNA 3′端非編碼區(qū)及基因組中某些長的非編碼區(qū)域也可產(chǎn)生piRNA[4]。

1.2 piRNA的生物合成 新生piRNA常被運至核外，在胞質(zhì)被加工成熟，然后再發(fā)揮其生物學(xué)功能。piRNA產(chǎn)生機(jī)制分為初級piRNA途徑和次級piRNA途徑，主要圍繞Slicer活性剪切的“乒乓”擴(kuò)增循環(huán)過程。完成piRNA的成熟加工后[4-5]，在對piRNA“乒乓”循環(huán)的深入與細(xì)化研究發(fā)現(xiàn)除動物的生殖細(xì)胞外，體細(xì)胞中也存在piRNA合成途徑，且生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中piRNA“乒乓”擴(kuò)增過程存在一定差異。piRNA體細(xì)胞途徑可直接依賴Piwi蛋白和piRNA簇Fla-menco片段產(chǎn)生piRNA，以轉(zhuǎn)座子為靶標(biāo)合成piRNA，首先piRNA前體與細(xì)胞器Yb小體結(jié)合，在Zuc及輔助因子(Vret、Mino、Gasz等)作用下形成中間體piRNA的5′U位點，再產(chǎn)生piRNA次級結(jié)構(gòu)，Zuc對Piwi-piRNA序列剪切形成3′末端，并通過外切酶Trimmer、Papi作用切割Piwi-piRNA成熟位點，接著發(fā)生Hen1介導(dǎo)的甲基化，最后成熟的Piwi-piRNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮沉默作用，線粒體膜外因子在該途徑發(fā)揮重要作用[6]。

1.3 piRNA特點 與siRNAs、miRNAs相比，piRNAs的數(shù)量較多，約5×104種；它產(chǎn)生不依賴于RNase類核酸酶，長度略大于前2者，一般在24～35 nt范圍內(nèi)；3′端甲基化修飾，5′端第一個核苷酸有尿嘧啶偏向性，且第10位的堿基有腺嘌呤偏向性[7]。小鼠體內(nèi)piRNA集中分布在X染色體上，Y染色體上分布很少；然而人體內(nèi)的piRNA絕大多數(shù)分布在常染色體上，性染色體上幾乎不分布。

1.4 piRNA功能

1.4.1 piRNA參與轉(zhuǎn)錄沉默 以往在植物與酵母中研究小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默，認(rèn)為核Piwi蛋白的存在以及某些piRNA途徑突變體中抑制性組蛋白標(biāo)記或DNA甲基化的種種巧合才使動物中出現(xiàn)Piwi依賴性轉(zhuǎn)錄沉默。但隨著研究不斷進(jìn)行，已經(jīng)找到了piRNA途徑轉(zhuǎn)座子沉默的直接通路，其中Piwi主要作用于轉(zhuǎn)錄水平[8]。這些研究表明成熟的Piwi復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核并掃描可能是新生的轉(zhuǎn)座子產(chǎn)物[9]。在檢測之后，通過形成異染色質(zhì)來強(qiáng)制執(zhí)行轉(zhuǎn)錄抑制。同時猜測piRNA還有抑制外源序列片段插入的功能[10]。

1.4.2 參與表觀遺傳及生殖系功能調(diào)控 Piwi作為表觀遺傳調(diào)控因子，對生殖干細(xì)胞正常功能有支持作用[11]。Polycombgroup(PcG)蛋白的存在能維持必要的發(fā)育調(diào)節(jié)因子。果蠅中PcG與PcG反應(yīng)元件結(jié)合可以沉默持家基因，Piwi與PcG蛋白體共定位簇集成PcG反應(yīng)序列[12]，暗示Piwi相關(guān)的piRNA可能參與到表觀遺傳調(diào)控。就RNA積聚而假設(shè)的RNA沉默機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，積聚的RNA包括多種gypsy序列并且沉默效果與卵巢中25～30 nt長度的有義RNA的存在量有關(guān)，重復(fù)相關(guān)小RNA對gypsy轉(zhuǎn)錄本有義鏈具有下調(diào)的作用[13]。而且，在雄性生殖系中，Piwi蛋白能夠阻止逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄[14]。這些證據(jù)表明某些piRNA可能與后生調(diào)控有關(guān)。

Miwi，Mili和Miwi 2是Piwi亞家族的3個關(guān)鍵蛋白，特異性存在于生殖系細(xì)胞[15]，與精子的發(fā)生密切相關(guān)，假如敲除Miwi，Mili或Miwi 2基因，都會使小鼠精子出現(xiàn)明顯缺陷，通常為雄性不育[16]。敲除Mili，小鼠精子發(fā)生過程會停在粗線期；敲除Miwi小鼠的生殖細(xì)胞隨齡期會有明顯損失[15]。Miwi 2突變體中生殖細(xì)胞表型與果蠅中Piwi突變體相同，可見兩者的Piwi在維持生殖系和干細(xì)胞發(fā)生時起著相似作用。

1.4.3 維持發(fā)育及基因完整性 果蠅中piRNA作用異常會引發(fā)DNA損傷信號導(dǎo)致軸線發(fā)育特異性缺陷[17]。細(xì)胞周期監(jiān)測點激酶2(checkpoint kinase-2,Chk-2)由基因mnk編碼,減數(shù)分裂時受損的DNA使Chk-2活化,進(jìn)而引起特異性發(fā)育缺陷，piRNA作用通路異常的后果與DNA修復(fù)相關(guān)基因突變相似,通過激活Chk-2作用通路產(chǎn)生結(jié)果。在果蠅卵子發(fā)生時,piRNA通路異常會導(dǎo)致由動力蛋白介導(dǎo)的微管動力復(fù)合體聚集[18]，這一過程依賴于Chk-2的激活。Wu等[18]發(fā)現(xiàn)DNA損傷時會出現(xiàn)核蛋白聚集體,piRNA產(chǎn)生缺陷使逆轉(zhuǎn)座子RNA水平上調(diào)。piRNA缺失時,馬達(dá)動力蛋白機(jī)制使逆轉(zhuǎn)座子RNA運至逆轉(zhuǎn)座子降解位點并在此集結(jié)。此外,piRNA在DNA修復(fù)過程和維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對抗DNA損傷方面或許還應(yīng)該具有更直接的作用。不僅如此，piRNA在維持mRNA的穩(wěn)定上也扮演著不可或缺的角色[19]。

1.4.4 piRNA對性別的影響 斑馬魚中有2種Piwi同源蛋白Ziwi和Zili。Ziwi蛋白與小鼠Miwi蛋白同源,Zili蛋白與小鼠Mili蛋白更近似。Ziwi在不同性別間表達(dá)存在特異性，Ziwi基因突變會引起生殖細(xì)胞凋亡的缺失[20]。而降低Ziwi表達(dá)水平雄性生殖細(xì)胞依然可以存活到成熟階段,但成熟后凋亡水平卻會顯著提升且有多層次的不育癥。斑馬魚卵巢中piRNA與其他器官piRNA分子功能相同且多是同源。Ziwi突變會影響斑馬魚性別決定,突變體中只有雄性可以存活[21]。

2 piRNA在心臟生理學(xué)和病理生理學(xué)中研究進(jìn)展

2.1 piRNA在心臟組織中的表達(dá) 小鼠Piwi蛋白組同源基因Miwi、Mili和Miwi 2分別與人類的Piwil 1、Piwil 2和Piwil 4同源。對于piRNA在體細(xì)胞中的表達(dá)情況的研究還不甚清楚，Perera等[22]為檢測體細(xì)胞中piRNA的表達(dá)情況，他們對小鼠不同組織中負(fù)責(zé)合成Piwil 1、Piwil 2和Piwil 4的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)，Piwil 1 mRNA在生殖系(睪丸和卵巢)以及包括大腦、海馬和心臟在內(nèi)的多個體細(xì)胞組織中均有表達(dá)；在心臟中Piwil 1 mRNA表達(dá)水平非常低；而Piwil 2 mRNA表達(dá)量相對很高；Piwil 4 mRNA在所有組織中均有表達(dá)[22]。由此可見，piRNA與心臟組織有著密切的關(guān)系，這也預(yù)示著piRNA與心臟相關(guān)疾病的研究有巨大潛力。

2.2 piRNA在心臟祖細(xì)胞中的潛力 心臟祖細(xì)胞，如心臟球、心臟圈衍生細(xì)胞，是心臟再生的一種備受關(guān)注的細(xì)胞來源。但心臟祖細(xì)胞的piRNA信號還未被研究。有文獻(xiàn)研究表明通過微陣列分析了15 311個piRNAs在心臟球、心臟圈衍生細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示一組差異表達(dá)的piRNAs(折疊變化≥2，P<0.01)：與心臟圈衍生細(xì)胞相比，心臟圈衍生細(xì)胞中有641個piRNAs上調(diào)，1 301個piRNAs下調(diào)，而與心臟成纖維細(xì)胞相比，255個和708個piRNA分別上調(diào)和下降。還鑒定出181個piRNAs在心臟圈衍生細(xì)胞中過度表達(dá)，129個piRNA在心臟纖維細(xì)胞中下調(diào)[23]。piRNAs可能在不久的將來作為心臟相關(guān)疾病的一個臨床檢測靶標(biāo)。

2.3 piRNA與心肌損傷修復(fù) 最近證據(jù)表明，piRNA在體細(xì)胞中也有表達(dá)，包括心肌細(xì)胞[24]。有報道稱，miRNAs和piRNAs影響Akt信號通路，這是心臟病理生理學(xué)中的一個關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)[25]。因此，piRNAs在心肌細(xì)胞的增殖和再生中也可發(fā)揮作用。piRNA能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子的表達(dá)和關(guān)鍵分子通路作為Akt信號大量piRNA的表達(dá)可誘導(dǎo)Akt活化[25]。Rajan等[26]，研究表明miRNAs和piRNAs都能改變心臟疾病中的Akt通路，Akt是一種存活信號，能促進(jìn)心肌干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖和心肌細(xì)胞的存活。值得注意的是，許多心臟保護(hù)配體-受體系統(tǒng)激活了Akt信號通路，解除對Akt通路管制涉及心臟重塑和得失代償，從而導(dǎo)致心臟病的發(fā)展。Akt信號通路是通過調(diào)節(jié)線粒體功能和活性氧的產(chǎn)生以及線粒體的能量代謝，從而減少了心臟缺血損傷[27]。這些證據(jù)揭示piRNAs在調(diào)控心臟生理和病理的網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用[28]。

2.4 piRNA與心肌胚層分化 胚胎干細(xì)胞具有分化為包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的3種胚層細(xì)胞的潛力[29]，是幫助理解心臟發(fā)育的一個完美模型。Li等[30]使用小RNA深度測序，研究了小鼠心臟分化早期的小RNA組，發(fā)現(xiàn)piRNAs在心臟分化過程中也有表達(dá)，并列出了分化過程中最豐富的20個piRNAs，給出了規(guī)范化讀取計數(shù)的表達(dá)式分析，例如，piR-1078在D0上輕度表達(dá)，但在D2上表達(dá)增加9倍，并逐漸減少。這些數(shù)據(jù)表明，piRNA通路可能是控制心肌胚層維持和(或)分化進(jìn)程的重要調(diào)控因子。

2.5 piRNA與心肌肥大、心肌梗死 心肌肥大與心肌梗死在心血管疾病的研究中是必不可少的。有研究者在體內(nèi)與體外條件下分別誘導(dǎo)的心肌肥厚模型，通過小RNA測序分析[31]，驗證了piRNAs的表達(dá)，此外通過qPCR和RNA免疫沉淀研究了心肌梗死患者中是否存在piRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心肌肥厚過程中，piRNAs表達(dá)豐富且發(fā)生改變；采用qPCR和RNA免疫沉淀法對差異表達(dá)的piRNAs進(jìn)行了驗證，預(yù)測大鼠基因組中具有顯著差異表達(dá)的piRNAs靶標(biāo)不同的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和mRNA。心肌梗死患者血清中特異性piRNA的檢測提示了piRNA的診斷價值。這項研究首次對心臟系統(tǒng)中大量的piRNA進(jìn)行全基因組分析，為了解piRNA和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在心臟相關(guān)疾病分子病因?qū)W奠定了新的基礎(chǔ)。

3 展望

piRNA是一類新穎且潛力無限的小分子非編碼RNA，它種類豐富且雜亂無章，表達(dá)隨發(fā)育階段不同而改變，不同piRNA表達(dá)量間有較大差異。非編碼小RNA具有很好的靈活性，它既能以堿基互補(bǔ)配對的方式與DNA結(jié)合，又可以通過自身的高級結(jié)構(gòu)(如形成發(fā)夾等結(jié)構(gòu))與蛋白質(zhì)結(jié)合，在基因和蛋白質(zhì)之間架起一個連接的橋梁。雖然對于臨床應(yīng)用piRNA治療心臟相關(guān)疾病的研究還處于探索階段，但是已經(jīng)得到了研究者足夠的重視。目前對于piRNA的研究大部分集中在腫瘤領(lǐng)域，但從長遠(yuǎn)來看piRNA在心臟相關(guān)疾病的研究上潛力巨大。