阮錦達 梁惠瑩

缺血性卒中、冠心病、靜脈血栓栓塞等血栓栓塞性疾病是最主要的人類致死性病因［1］。作為臨床預防和治療血栓性疾病的基礎手段,包括纖溶、抗凝、抗血小板藥物在內(nèi)的預防血栓藥物均存在主要和共性的缺陷是具有出血傾向和嚴重出血危險。降低出血傾向、與病理性血栓形成相關而不影響生理性止血功能的藥理學作用靶點是預防血栓基礎藥理學及新藥應用研究的核心和重點。國內(nèi)研究表明,SV 為來源于Stichopus variegatus 的巖藻糖化糖胺聚糖的解聚后純化得到的純品化合物九糖,SV 是選擇性內(nèi)源性凝血因子Xa 抑制劑(IC50=30 nm),Xase 是內(nèi)源性凝血途徑上的最后一個酶學位點,也是多種因素激發(fā)的凝血過程的限速位點［2-4］,其抑制內(nèi)源性凝血活性與依諾肝素相當,在等效抗凝血劑量的倍數(shù)劑量下,出血傾向顯著降低。

1 選擇性內(nèi)源性凝血因子抑制劑類預防血栓藥物研發(fā)熱點

1.1 內(nèi)源性凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ基因敲除能抵抗病理性血栓 生理性止血與病理性血栓形成存在時間和空間上的差異,生理性止血血栓在血管外周快速形成,而病理血栓則在血管內(nèi)緩慢形成,理論上,其調(diào)節(jié)機制也應當有所不同。近年來,關于生理、病理凝血機制差異的基礎研究正在取得進展,內(nèi)源性途徑在病理血栓和止血功能中的作用差異受到越來越多的關注［5-8］。缺乏凝血因子Ⅻ人群沒有出血傾向,缺乏凝血因子Ⅺ出血傾向輕微,缺乏凝血因子Ⅸ出血傾向明顯(如血友病B),臨床罕見內(nèi)源性途徑及共同途徑凝血因子完全缺乏者?；蚯贸囼灠l(fā)現(xiàn),內(nèi)源性凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ基因敲除動物的出血傾向與人體臨床發(fā)現(xiàn)基本一致,而外源性途徑及共同途徑凝血因子基因敲除,則動物不能完成胚胎發(fā)育。近十年來的研究表明,Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ基因敲除動物均能抵抗病理性血栓形成［9-11］。

1.2 低出血傾向的內(nèi)源性途徑凝血因子抑制劑成研發(fā)的熱點 一些基礎研究結(jié)果表明,外源性途徑及共同途徑凝血因子為生理性止血以及基本生命功能所必須,但是內(nèi)源性凝血因子Ⅻ非止血功能所必須,Ⅺ與止血功能弱相關,僅維持血栓穩(wěn)定；Ⅸ參與凝血“擴增(propagation)”,但僅在低于正常血漿水平的5%情況下,才顯著影響止血功能,如血友病。而內(nèi)源性凝血因子與病理性血栓形成的相關性更為密切,理論上,選擇性的內(nèi)源性凝血因子抑制劑在抑制病理性血栓形成時可能較少或不影響止血功能,此為低出血傾向的藥物研發(fā)開啟一道希望之門。此外,應用研究發(fā)現(xiàn),外源性途徑Ⅶ抑制劑(單抗) 及重組組織因子途徑抑制劑(TFPI) 的新藥研發(fā)遭遇出血危險增加［12,13］。而一系列關于Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ抑制劑,包括單抗、適配體(Aptamer)、蠕蟲抗凝肽等的預防血栓藥理學研究顯示,這些抑制劑在預防血栓劑量下對止血功能沒有影響或影響較弱,選擇性的內(nèi)源性途徑凝血因子抑制劑已成為新一代低出血傾向抗凝藥物研發(fā)的重點方向。目前,內(nèi)源性凝血因子抑制研究中,由于選擇性Xase 抑制劑未見報道,FXase 抑制相關的預防血栓效應仍有待闡明。Xase 是內(nèi)源性凝血途徑上的最后一個酶學位點,也是多種因素激發(fā)的凝血過程的限速位點。從預防血栓藥物研究進展來看,低出血傾向的新靶點抗凝藥物研究正在期待突破,Xase 是內(nèi)源性凝血途徑的末位和限速酶活位點,是可能的抗凝藥物作用靶點［14］。

2 研究實驗方案設計及探討

2.1 SV 對凝血途徑激活所致關鍵凝血因子形成的影響 通過血漿化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)檢測,可用于區(qū)分SV 對內(nèi)源性凝血途徑及外源性凝血途徑的不同影響。病理性血栓與止血血栓的形成機制存在差異。例如,血漿微量成分如聚磷酸胺(APP)/聚丙烯(PP)的表面激活活性與緩慢的病理性血栓形成相關,而組織因子(TF)暴露及血小板活化釋放的活性因子則誘導快速止血血栓形成。比較研究SV 對APP 和TF 誘發(fā)的凝血過程的抑制作用,可用于分析SV 低出血傾向預防血栓活性相關的藥理學機制。凝血過程中的重要活性因子如Xa/Ⅱa 生成量檢測可用于分析藥物影響凝血過程的機制特征。血漿Xa 可由外源性途徑的Ⅶa-TF 或內(nèi)源性途徑的Xase(Ⅷ-Ⅸa 復合物)激活形成。在稀釋血漿系統(tǒng)中,由于反饋激活機制的參與,少量和過量TF 或Ⅻa 激活的Xa 以及下游Ⅱa 生成機制存在差異。Ⅱa 的生成量還與因子V 的反饋激活機制相關。乏因子血漿以及藥理學工具藥的使用,還可以進一步分析Xa/Ⅱa 生成量與藥物靶點機制之間的相關性。因此,采用不同強度的內(nèi)源性和外源性凝血激活方法,以生色底物法檢測血漿Xa 和Ⅱa 的生成,可以細致和系統(tǒng)地分析SV 影響內(nèi)源性、外源性及共同途徑凝血過程的特征性機制。

2.2 SV 對血小板活性及血漿活性因子的影響 原型纖維蛋白原(Fg)存在血小板激活活性,而SV 已消除該活性,且對凝血酶等誘導的血小板聚集具有一定的抑制活性,對膠原、花生四烯酸(AA)等誘導的血小板聚集無顯著影響。對比研究SV 對血小板活性的影響,可進一步認識SV 的預防血栓活性與其血小板活性影響的相關性。天然Fg 對血漿粘附因子,特別是P 選擇素有顯著的抑制活性,其機制可能與其“三糖結(jié)構單元”和唾液酸化的路易斯寡糖-X 抗原(SLex)三糖的空間結(jié)構相似相關。由于P 選擇素等參與血栓形成,研究SV 的抑制活性,可進一步分析活性成分對血栓形成相關的復雜病理過程的干預。

2.3 SV 對血栓形成及出血傾向的影響 探討采用實驗動物學模型進一步分析SV 對不同因素所致血栓形成的抑制活性強度及其對止血功能,包括出血量和出血時間的影響。通過分別采用病理性血栓形成相關的表面激活(如Ⅻa,pp 等)以及止血血栓形成相關的外源性凝血途徑(如組織因子、血小板活性因子等)激活因子所致血栓形成模型,可區(qū)分SV 預防血栓活性的機制特點及其對血栓和止血功能的影響差異。分析檢測不同因素所致血栓形成過程中的活性凝血因子(如Xa、Ⅱa 等)水平、血小板活性以及粘附因子活性(如P 選擇素)水平,可以進一步探討SV 預防血栓活性和止血功能影響與其藥理學靶點機制之間的相關性。通過不同給藥途徑 ［靜脈注射(iv).皮下注射(sc)］下的藥-時曲線和藥效動力學(如APTT 影響)比較,分析其藥代動力學和藥效動力學之間的相關性,以考察其潛在應用價值。

3 研究前景

腦血栓形成是腦梗死最常見的類型。迄今為止,公認有效的腦梗死急性期治療用藥僅重組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)一種,歐、美、日等發(fā)達國家長期以來開展大量的腦卒中治療藥物研究工作,但尚未取得突破性進展。腦梗死治療藥物研究基本上可歸結(jié)于抗血栓和腦保護兩個方向,抗血栓治療時腦卒中對因治療的主要措施為SV 的藥理學作用是強效抑制內(nèi)源性因子X 酶(FXase),后者是凝血瀑布中內(nèi)源性凝血途徑的最后一個靶點,具有良好的抗血栓活性,同時,與相同效價的作用共同途徑的抗凝藥物,對于出血傾向的影響顯著降低。理論上,SV 強效作用于內(nèi)源性途徑的抗凝特征有利于保障腦梗死患者獲益于抗凝治療,同時抑制凝血瀑布中內(nèi)源性凝血途徑的最后一個靶點的藥理學特點有利于降低出血傾向副作用,由此使患者獲得更多的“凈受益”。