申震 姜自偉 陳國茜 李定 張嚴(yán) 李紫閣 黃楓

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，廣東 廣州 510405

骨是一種高度血管化的組織，在整個機(jī)體生命周期中經(jīng)歷著持續(xù)的吸收和重建過程，而在此過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)和骨細(xì)胞之間在空間和時間上密切連接以保持骨骼的完整性[1]。血管生成是各類器官發(fā)生中最早的事件之一[2]，骨血管系統(tǒng)在骨骼發(fā)育、重塑以及維持骨量平衡中均起著重要作用[3-8]。在骨生長發(fā)育和修復(fù)期間，新血管生成是重要的環(huán)節(jié)，二者都涉及血管生成和骨生成信號途徑之間的激活和復(fù)雜的相互作用，而血管生成發(fā)生在骨生成之前[9]，且新生血管可確保循環(huán)成骨細(xì)胞前體和破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)運至特定部位[10]。這說明骨生成是一個血管依賴性過程，血管生成與骨生成空間和時間上密切的關(guān)系被稱為“成血管-成骨耦聯(lián)”作用[3,11-12]。近年來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)骨內(nèi)微小血管生成和骨內(nèi)微環(huán)境在成骨和骨量維持等方面同樣扮演著重要角色[13]。據(jù)報道[14]，骨內(nèi)還存在兩種具有不同形態(tài)、功能和空間分布的特異性血管ECs亞型，即對血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31/PECAM-1)和內(nèi)皮粘蛋白(endomucin，Emcn)高表達(dá)的H型ECs(CD31hiEmcnhi)以及對CD31和Emcn低表達(dá)的L型ECs(CD31loEmcnlo)。其中H型ECs在介導(dǎo)血管生成和骨生成耦聯(lián)過程中起著重要作用，H型血管不僅可向骨組織供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、激素、趨化因子和細(xì)胞因子以及傳輸代謝廢物，還充當(dāng)了骨骼和鄰近組織之間的交流網(wǎng)絡(luò)[15]，由H型血管釋放的血管分泌因子傳遞信號調(diào)控著骨生長和骨穩(wěn)態(tài)，并進(jìn)一步增強(qiáng)血管生成和骨生成間的相互聯(lián)系[14，16]。這不僅豐富了血管與骨相互作用間的內(nèi)容，還為探究成血管-成骨耦聯(lián)機(jī)制提供了新的研究方向。故本文就成血管-成骨耦聯(lián)相關(guān)因子、細(xì)胞及機(jī)制在骨中所起的作用進(jìn)行綜述。

1 成血管-成骨耦聯(lián)調(diào)節(jié)因子

1.1 血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前研究最多且是已知的誘導(dǎo)血管生成最強(qiáng)的一種細(xì)胞因子，是促進(jìn)血管生成相關(guān)的分子和細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[17]。雖然VEGF主要作用于ECs，但也可與成骨細(xì)胞等其他類型細(xì)胞上的VEGF受體相結(jié)合[18-19]，最終通過血管發(fā)生、血管生成或淋巴管系統(tǒng)形成等形式促進(jìn)血管系統(tǒng)的發(fā)育[20-21]。然而，VEGF不僅對血管生成具有重要作用，在骨生長發(fā)育過程中同樣扮演重要角色[22-23]。一方面VEGF自身就具有促進(jìn)成骨的能力，既能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的趨化性、增殖和分化，調(diào)控成骨細(xì)胞的活性從而對成骨產(chǎn)生直接作用[24]；另一方面又能調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，或通過血管生長機(jī)制刺激ECs產(chǎn)生成骨細(xì)胞因子，促進(jìn)祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化而發(fā)揮間接作用[25]。Geiger等[24]發(fā)現(xiàn)處于生長階段長骨中的血管尚未完全形成之前均能檢測到VEGF的表達(dá)，并且該表達(dá)與骨生成過程有關(guān)。與此同時，VEGF還具有趨化作用可使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨缺損區(qū)域富集，通過促進(jìn)血管生成、軟骨吸收以及軟骨內(nèi)成骨的分化來促進(jìn)新骨生成。而當(dāng)抑制VEGF表達(dá)或VEGF表達(dá)降低時，則會導(dǎo)致成骨障礙或骨量丟失。VEGF及其相關(guān)血管對骨生成發(fā)揮重要作用，但血管網(wǎng)絡(luò)的生長又受成骨細(xì)胞所提供的信號調(diào)控[14]。VEGF通過直接或間接作用于成骨細(xì)胞促進(jìn)骨的生長發(fā)育，而成骨細(xì)胞又能分泌VEGF等因子反作用調(diào)控血管生成[26]。Huang等[27]在小鼠及體外細(xì)胞實驗中證實了成骨細(xì)胞尚能分泌趨化因子Cxcl-9(C-X-C motif ligand- 9)調(diào)節(jié)血管生成，Cxcl-9能與VEGF相互作用并阻止其與VEGF受體結(jié)合，繼而阻止VEGF與ECs和成骨細(xì)胞結(jié)合，從而抑制血管生成和骨生成。因此，減少骨內(nèi) Cxcl-9 含量，增加骨內(nèi)血管生成，從而為骨生成和再生提供了新的作用靶點。而VEGF與成骨細(xì)胞間的相關(guān)作用也正是成血管-成骨耦聯(lián)作用的一種體現(xiàn)。

1.2 血小板衍生生長因子-BB

血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)在骨生成過程中由脫顆?；“遽尫?。據(jù)報道[28]，PDGF-BB既能通過上調(diào)VEGF而刺激血管生成，又可通過對成骨細(xì)胞施加趨化性和促有絲分裂信號促進(jìn)成骨。Xie等[29]在研究中發(fā)現(xiàn)位于骨膜處的破骨前體細(xì)胞可分泌PDGF-BB，一方面PDGF-BB可刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞和MSCs的遷移，并促進(jìn)血管生成[30]。另一方面PDGF-BB被認(rèn)為是能夠調(diào)動間充質(zhì)來源細(xì)胞，穩(wěn)定新生血管并協(xié)調(diào)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞成分[31]。除此之外，PDGF-BB可誘導(dǎo)H型血管生成以促進(jìn)血管生成與骨生成之間的耦聯(lián)作用[29]。研究發(fā)現(xiàn)，在骨膜骨中PDGF-BB誘導(dǎo)H型血管生成并刺激1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1 phosphoric acid，S1P)分泌以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，繼而促進(jìn)新骨生成；在骨小梁重塑過程中，PDGF-BB同樣誘導(dǎo)生成H型血管，但在骨重塑期間主要發(fā)揮物質(zhì)傳輸作用。

1.3 轉(zhuǎn)化生長因子-β

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor -β，TGF-β)是一種多效能生長因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、調(diào)控細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，同時可刺激細(xì)胞外基質(zhì)分泌與沉積，在骨生成與血管生成方面扮演重要角色[32]。Tang等[33]首先證實了TGF-β是一種重要的趨化募集因子，參與MSCs的募集和增殖，不僅可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞前體向骨重塑部位轉(zhuǎn)移。與此同時，TGF-β促進(jìn)成骨細(xì)胞的新陳代謝和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，通過抑制破骨細(xì)胞的生成和成熟破骨細(xì)胞的活性，實現(xiàn)抑制骨吸收和促進(jìn)成骨的目的。除了在成骨方面的重要作用，TGF-β還可調(diào)節(jié)造血細(xì)胞和血管ECs中VEGF的表達(dá)，從而在成骨過程中對血管化進(jìn)程產(chǎn)生積極影響，繼而加強(qiáng)血管生成與骨生成之間的耦聯(lián)關(guān)系[34]。

1.4 低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-1α

低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子-1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)是成血管-成骨級聯(lián)反應(yīng)啟動所必需的因素，是協(xié)調(diào)成血管-成骨耦聯(lián)基因程序的主要調(diào)節(jié)物。當(dāng)局部缺血、缺氧時，HIF-1α、VEGF、PDGF-BB等促血管生成因子表達(dá)以激活ECs[35]。與此同時，缺氧細(xì)胞向血管元件發(fā)出信號，以確保發(fā)育中血管系統(tǒng)的適當(dāng)分化。成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和ECs含有必需的細(xì)胞元件以感知和響應(yīng)組織中氧氣張力的變化，并在時間和空間上協(xié)調(diào)骨生成[1]。在軟骨內(nèi)化骨過程中，軟骨內(nèi)骨生長板的間充質(zhì)濃縮階段即是缺氧狀態(tài)并且表達(dá)HIF-1α[36]，而HIF-1α的缺失可導(dǎo)致肥大軟骨細(xì)胞VEGF表達(dá)下降，這表明肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生VEGF也可能受HIF-1α機(jī)制的調(diào)控。此外，HIF-1α刺激微環(huán)境中產(chǎn)生VEGF，先是VEGF在軟骨膜中表達(dá)，刺激軟骨膜血管發(fā)生，隨后在增生性軟骨中VEGF表達(dá)升高從而引發(fā)血管侵入軟骨，繼而為軟骨內(nèi)化骨后續(xù)過程奠定血運基礎(chǔ)。除此之外，成骨細(xì)胞也表達(dá)HIF途徑的組分，并在長骨形成過程中促進(jìn)骨骼血管生成。這些研究表明缺氧是骨生成過程中誘導(dǎo)血管生成的主要驅(qū)動力，而HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子和其靶基因VEGF是成血管-成骨耦聯(lián)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究證實HIF-1α對H型ECs誘導(dǎo)起著關(guān)鍵作用，通過維持HIF-1α活性可促進(jìn)H型ECs的生成，并可提高成骨細(xì)胞分泌成血管因子的能力從而促進(jìn)H型血管生成[37]。

2 成血管-成骨耦聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞

血管與骨在物理和生物化學(xué)上存在密切聯(lián)系，遺傳學(xué)、生物化學(xué)和藥理學(xué)研究已經(jīng)證實在骨生成和修復(fù)期間ECs和成骨細(xì)胞存在相互作用。血管生成與骨生成相互耦聯(lián)，也表明ECs和成骨細(xì)胞之間存在信號調(diào)控間的分子串話[38]。而ECs是血管最重要的組成部分之一，在成熟的血管系統(tǒng)中ECs在維持周圍組織的穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，既為鄰近組織提供交流網(wǎng)絡(luò)，又能在需要時作為屏障來限制分子和細(xì)胞的運動[15]。此外，ECs在維持骨穩(wěn)態(tài)方面同樣扮演重要角色，不僅可作為高通透性屏障起作用，還可分泌活性因子促使包括造血細(xì)胞在內(nèi)的循環(huán)細(xì)胞被募集到骨內(nèi)。更為重要的是，Maes等[11]發(fā)現(xiàn)的高度特異性的H 型ECs在骨局部微環(huán)境中可以生成特異性H型血管介導(dǎo)循環(huán)細(xì)胞，同時促進(jìn)氧氣、營養(yǎng)物和廢物的傳輸，還能介導(dǎo)成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和血管ECs之間的相互作用，釋放血管分泌信號調(diào)控成骨作用和骨平衡[39-40]。在成骨過程中，ECs侵入生長板區(qū)域的軟骨形成一個用于營養(yǎng)供應(yīng)的血管通道，并作為新骨形成的支架[41]。新生成血管可確保成骨細(xì)胞前體和破骨細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)運至重塑部位，有助于進(jìn)一步促進(jìn)骨吸收和骨生成。除此之外，ECs易受到低氧、機(jī)械或VEGF的影響，在骨修復(fù)過程中，由于骨折后血液供應(yīng)遭到破壞，氧氣供應(yīng)中斷和周圍組織的急性壞死在受傷的縫隙周圍形成低氧環(huán)境，這種缺氧環(huán)境誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生HIF-1α等調(diào)節(jié)因子，繼而影響ECs增殖、分化，并誘導(dǎo)ECs分泌成骨生長因子反作用于成骨細(xì)胞。血管和骨骼內(nèi)的ECs還可以調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移到骨折部位促進(jìn)骨修復(fù)，并可促進(jìn)循環(huán)細(xì)胞特別是造血細(xì)胞對骨髓的調(diào)節(jié)，將它們定向轉(zhuǎn)移到骨骼區(qū)域。而當(dāng)ECs功能異常引起骨組織血管供應(yīng)發(fā)生改變時，則會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥、骨折延遲愈合甚至骨不連等骨骼病變。

2.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是在骨髓和外周血中循環(huán)的另一類細(xì)胞群體，具有比成熟的ECs更強(qiáng)的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠在體外培養(yǎng)出EC并促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)的形成，而EPCs介導(dǎo)的血管形成是骨生成或修復(fù)不可或缺的關(guān)鍵因素[42]。骨生長發(fā)育過程中新血管形成主要通過血管生成和血管發(fā)生兩種方式，EPCs對以上兩種方式都有積極作用。其中血管發(fā)生是指在沒有預(yù)先存在的血管成分情況下，通過局部或循環(huán)EPCs的分化發(fā)生[43]，這表明EPCs在血管形成中扮演著重要角色。此外，EPCs可通過旁分泌機(jī)制誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞的募集、增殖和分化，并在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞促進(jìn)成骨作用[44]。Lee等[45]發(fā)現(xiàn)在大鼠牽張成骨模型中EPCs移動到缺損愈合部位的現(xiàn)象明顯增加。Atesok等[46]證實EPCs在骨折愈合過程中引發(fā)新血管生成和新骨生成，自體EPCs移植可以促進(jìn)臨界尺寸缺損的血管生成和骨生成。

2.3 壁細(xì)胞

壁細(xì)胞，即骨內(nèi)包含的血管周圍間充質(zhì)細(xì)胞群，主要分布在血管周圍，其在調(diào)節(jié)造血、骨生成和血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的功能作用。在H與L型血管周圍存在著大量的多種類型的壁細(xì)胞。其中在干骺端的柱狀H型毛細(xì)血管被血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)陽性細(xì)胞和神經(jīng)/膠質(zhì)抗原-2(neurogia -2，NG-2)細(xì)胞包圍，這些壁細(xì)胞被H型ECs分泌的PDGF-B所調(diào)控[47]，在血細(xì)胞生成、骨生成和血管穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起重要功能作用。而L型竇狀血管則被另外兩種壁細(xì)胞包圍，一種是對瘦素受體(leptin receptor，LEPR)表達(dá)陽性的LEPR+細(xì)胞，另一種是富含CXCL-12的網(wǎng)狀細(xì)胞(CXCL-12-abundant reticular，CAR)，但對PDGFR-β和NG2表達(dá)呈陰性[48]。研究表明[49]這些壁細(xì)胞聚集在H與L型血管周圍，通過分泌CXCL-12、干細(xì)胞因子和血管生成素等分子信號增強(qiáng)了成血管與成骨之間的密切聯(lián)系和相互作用。

3 成血管-成骨耦聯(lián)相互作用

ECs和成骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞前體空間結(jié)構(gòu)上的緊密聯(lián)系，既保證了二者之間進(jìn)行物質(zhì)交換，同時也為二者之間進(jìn)行信號交流、發(fā)揮協(xié)同作用奠定了基礎(chǔ)。Maes等[38]在由他莫昔芬誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因Rosa26R-LacZ受體小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞前體利用血管作為支持它們遷移的通道并沿著內(nèi)皮的近腔表面進(jìn)入骨骼，在遷移過程中血管轉(zhuǎn)輸而來的營養(yǎng)物質(zhì)以及活性因子不斷作用成骨細(xì)胞前體促進(jìn)其逐漸向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而成骨細(xì)胞以周細(xì)胞樣的方式侵入膜內(nèi)血管并和ECs被吸引到同一個由肥大細(xì)胞產(chǎn)生并表達(dá)特殊化學(xué)引誘物的軟骨，繼而將ECs生成的血管“拉入”到無血管的軟骨中促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨。最新的兩篇文獻(xiàn)[50-51]也證實了H型血管可增強(qiáng)成血管-成骨耦聯(lián)作用，對促進(jìn)新骨生成以及防治骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。一方面H型血管能夠產(chǎn)生獨特的代謝和分子微環(huán)境，既能運送成骨前體細(xì)胞至特定位置，又可以釋放血管分泌信號和骨生成分子進(jìn)行連接，介導(dǎo)成骨細(xì)胞系細(xì)胞與血管ECs之間的相互作用[14，52]。此外，H型ECs可與骨祖細(xì)胞相接觸，富集與骨祖細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的生長因子，維持骨組細(xì)胞的數(shù)量和活性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化。而另一方面，成骨細(xì)胞又是骨中造血微環(huán)境中的重要組成部分，Rankin等[53]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中HIF的失活導(dǎo)致促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)在骨骼中表達(dá)降低，而增強(qiáng)HIF活性可上調(diào)骨髓中造血干細(xì)胞和骨祖細(xì)胞的功能活性，通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中PHD/VHL/HIF通路可促進(jìn)EPO分泌和調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成。同時，成骨細(xì)胞中過表達(dá)HIF可使VEGF含量水平升高并形成血管化極其致密豐富的骨骼，而VEGF等生長因子信號又可以通過PI3K/AKT途徑激活成骨細(xì)胞中的HIF活性，繼而促進(jìn)血管生成和骨生成[54]。除此之外，骨細(xì)胞也能產(chǎn)生吸引血管朝向代謝活躍區(qū)域發(fā)展的局域性生長因子。骨發(fā)育過程中肥大軟骨細(xì)胞可釋放信號刺激軟骨痂的新血管生成，然后肥大軟骨細(xì)胞凋亡，破骨細(xì)胞募集引發(fā)骨痂重塑及其編織骨被取代，最終被礦化以充分支持骨骼的機(jī)械需求。而如果抑制血管生成則會阻礙成骨細(xì)胞替代軟骨細(xì)胞，在骨折愈合過程中則會出現(xiàn)組織中大量軟骨細(xì)胞而非成骨細(xì)胞聚積。同理，H型ECs如果生成減少或PDGF-BB分泌下降則會導(dǎo)致骨生成減少而骨吸收增加，骨生成和吸收之間出現(xiàn)紊亂的現(xiàn)象，繼而導(dǎo)致骨量流失、骨礦密度下降、骨質(zhì)疏松癥等問題[14，29,37]。

4 結(jié)語及展望

綜上所述，在骨生長發(fā)育及維持骨量平衡過程中，血管與骨之間密切相關(guān)，成血管-成骨耦聯(lián)涉及諸多生長因子、細(xì)胞和調(diào)控作用。血管對于骨骼的意義不僅體現(xiàn)在為骨生長和修復(fù)發(fā)揮氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、代謝廢物的轉(zhuǎn)輸作用，更為重要的是分泌因子、信號傳遞、功能調(diào)控等方面，而成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等對血管生成具有調(diào)節(jié)作用。與以往成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞功能耦聯(lián)的二元調(diào)控機(jī)制相比，血管ECs在其中的協(xié)調(diào)作用也同樣重要。然而，當(dāng)前有關(guān)成血管-成骨耦聯(lián)機(jī)制的研究尚不夠深入，尤其是H型ECs在各種生理和病理環(huán)境中的具體作用尚未被完全闡明，而了解血管生成和骨生成之間的耦聯(lián)關(guān)系將為探究骨疾病機(jī)理以及指導(dǎo)治療提供新的思路和策略。