謝瑩，蔡國林，劉逸凡，陸健

1(吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林，132022) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

雙歧桿菌作為益生菌，其營養(yǎng)性和治療作用已被廣泛認(rèn)可。主要包括平衡腸道菌群，改善乳糖耐受性，降低血液中的膽固醇水平及促進(jìn)維生素B族的生物合成等[1-3]。迄今為止，一些細(xì)菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)已經(jīng)進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)，并用于食品、藥品及保健品等領(lǐng)域，如黃原膠、結(jié)冷膠、右旋糖苷和透明質(zhì)酸等[4]，但雙歧桿菌等常用益生菌的胞外多糖還鮮有商業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。研究表明雙歧桿菌具有益生功能的主要分子機(jī)制依賴于自身分泌的胞外多糖[5]。益生菌胞外多糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化[6-7]、改善和提高免疫力[8]、抗炎癥[9]、抗腫瘤[10-11]以及降低膽固醇等益生功能[12]。本研究主要對雙歧桿菌BB12胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過體外試驗(yàn)進(jìn)行了胞外多糖抗氧化活性的研究，為開發(fā)益生菌胞外多糖在醫(yī)藥、食品和保健品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalsssp.lactis)BB12，江南大學(xué)食品學(xué)院提供。

1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g，加蒸餾水定容至1 L，醋酸調(diào)pH值為7。

1.3 主要試劑

酵母提取物、蛋白胨，上海生工生物工程有限公司；FeCl3、三氯乙酸、FeSO4、K3Fe(CN)6、KH2PO4、K2HPO4均為分析純，北京化工有限公司；鄰苯三酚、蒽酮、H2O2、Tris等試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.4.1 初始pH值對雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵的影響

將雙歧桿菌接種于改良MRS培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為6、6.5、7、7.5、8和8.5，37 ℃培養(yǎng)96 h，透析除去發(fā)酵液中的單糖和寡糖后測定發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量。采用蒽酮-硫酸比色法測定，方法參照《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》執(zhí)行[13]。

1.4.2 培養(yǎng)溫度對雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵的影響

將雙歧桿菌接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，分別在25、30、33、37和41 ℃培養(yǎng)96 h，測定發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量，方法同上。

1.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵的影響

將雙歧桿菌接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃分別培養(yǎng)48、60、72、84、96和108 h，測定發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量，方法同上。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化雙歧桿菌胞外多糖發(fā)酵條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇初始pH(A)、培養(yǎng)溫度(B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)作為響應(yīng)變量，以雙歧桿菌胞外多糖含量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken Design(BBD)方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過擬合得到二階響應(yīng)面模型，確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。

1.6 雙歧桿菌胞外多糖的體外抗氧化活性研究

1.6.1 還原能力測定

參考WANG等[14]的方法并進(jìn)行了改進(jìn)。將10 g/L的K3Fe(CN)61 mL、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液1.5 mL(pH 6.6)和純化后的多糖樣品(0.05、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)1 mL混勻后，50 ℃水浴20 min，向混合物中加入體積分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸1 mL，5 000 r/mim離心10 min，取上清，加入新鮮的1 g/L FeCl30.25 mL，混勻，700 nm波長處測定吸光度。去離子水和Vc分別作空白和陽性對照。

1.6.2 ·OH的清除作用

用H2O2-FeSO4體系研究胞外多糖對·OH的清除作用。將25 mmol/L FeSO41 mL、2 mmol/L水楊酸鈉1 mL、6 mmol/L H2O21 mL和純化后的多糖樣品(0.05、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)1 mL混合均勻，于37 ℃水浴30 min，8 000 r/min離心3 min，510 nm波長處測定吸光度，用相同質(zhì)量濃度的Vc作陽性對照[15]。·OH清除率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

(2)

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值，在圖中以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始pH值的影響

將雙歧桿菌BB12接種于不同pH值的改良MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量如圖1所示。初始pH值在6～7.5時(shí)，發(fā)酵液胞外多糖產(chǎn)量升高顯著(P<0.05)，在7.5～8時(shí)，升高不顯著(P>0.05)。當(dāng)初始pH值為8時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到最大值(129.5±5) mg/L，然后略有下降。雖然pH值在7.5～8.5時(shí)胞外多糖產(chǎn)量變化不顯著，但產(chǎn)量較高，可以通過后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，并對多因素間的顯著性進(jìn)行分析。

圖1 不同初始pH對EPS產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different initial pH on EPS yield注：不同的字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2 培養(yǎng)溫度的影響

雙歧桿菌BB12在不同溫度下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液胞外多糖的產(chǎn)量如圖2所示。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different incubation temperature on EPS yield

培養(yǎng)溫度對胞外多糖的產(chǎn)量具有雙重影響。溫度從25 ℃升高到37 ℃時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量增加顯著(P<0.05)，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到37 ℃，胞外多糖的產(chǎn)量最高為(109.8±4.9) mg/L，隨后下降不顯著(P>0.05)。因此，選擇37 ℃為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。當(dāng)培養(yǎng)溫度較低時(shí)，胞內(nèi)酶促反應(yīng)速率下降，導(dǎo)致菌體生長和代謝緩慢。培養(yǎng)溫度過高，細(xì)胞內(nèi)酶活性又重新受到抑制，使代謝產(chǎn)生的多糖含量降低。

2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間的影響

雙歧桿菌BB12在37 ℃培養(yǎng)不同時(shí)間，發(fā)酵液胞外多糖的含量見圖3。培養(yǎng)時(shí)間從48 h增加到96 h，胞外多糖的產(chǎn)量增加顯著(P<0.05)，培養(yǎng)96 h產(chǎn)量最高，為(125.8±6.5) mg/L，此時(shí)生長達(dá)到穩(wěn)定期，代謝活躍，不斷積累代謝產(chǎn)物。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，產(chǎn)量反而下降，但不顯著(P>0.05)，可能由于雙歧桿菌利用了自身產(chǎn)生的胞外多糖。因此，選擇96 h為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)一步研究不同因素間的交互作用。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間對EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different incubation time on EPS yield

2.2 雙歧桿菌BB12胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始pH值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間為自變量，胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，其結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 Design and results of response surface experiments

對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到胞外多糖的產(chǎn)量與初始pH值(A)、培養(yǎng)溫度(B)及培養(yǎng)時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=127.56+4.48A+7.14B+7.69C-2.13AB-3.38AC-2.00BC-4.08A2-11.96B2-7.91C2。對回歸模型進(jìn)行方差分析和可信度分析，結(jié)果如表2所示。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，模型F=31.74，P<0.000 1，說明該回歸方程是極顯著的。失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型模擬性較好，且R2分別為0.976 1和0.945 3，說明該模型具有較好的回歸性。模型數(shù)據(jù)顯示，一次項(xiàng)A、B、C及二次項(xiàng)B2、C2影響極顯著(P<0.01)，A2交互項(xiàng)AC影響顯著(P<0.05)，各因素的影響主次順序：C>B>A，即培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度>初始pH值。利用Design Expert 8.0.6軟件獲得了各因素的最佳培養(yǎng)條件為：初始pH值為8.11、培養(yǎng)溫度37.38 ℃、培養(yǎng)時(shí)間101.39 h，在此條件下獲得的胞外多糖產(chǎn)量預(yù)測值為130.308 mg/L。為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的有效性，考慮到實(shí)際操作的方便性，將各因素修正為初始pH值為8.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時(shí)間101 h，在此修正的最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出雙歧桿菌BB12胞外多糖的產(chǎn)量為(131.6±0.82) mg/L，經(jīng)顯著性分析，與響應(yīng)面中心點(diǎn)的5組平行試驗(yàn)得到的胞外多糖產(chǎn)量(127.56±2.03) mg/L相比具有顯著性(P<0.05)，雖然只改變了培養(yǎng)時(shí)間，但培養(yǎng)時(shí)間為主要影響因素，而且初始pH與培養(yǎng)時(shí)間交互項(xiàng)影響顯著，因此該優(yōu)化條件是可行的。

2.3 雙歧桿菌BB12胞外多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 還原能力測定

粗胞外多糖分別經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱和Sepharose CL-6B凝膠柱純化后，得到1個(gè)吸收峰，收集對應(yīng)的糖液凍干，進(jìn)行體外抗氧化活性研究(該試驗(yàn)結(jié)果圖沒有在本論文中列出)。胞外多糖的還原力如圖4所示，隨著多糖含量的增加，還原力呈線性增加，當(dāng)多糖初始質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL時(shí)，還原力趨于平穩(wěn)，但低于Vc的還原力。

圖4 EPS和Vc的還原能力Fig.4 Ferric reducing power of EPS and Vc

2.3.2 ·OH的清除作用

如圖5所示，雙歧桿菌BB12胞外多糖對·OH的清除效果較強(qiáng)，隨著多糖濃度的增加清除率升高，多糖初始質(zhì)量濃度在0～1 mg/mL的范圍內(nèi)，·OH的清除率高于Vc，50%清除濃度(IC50)為 0.47 mg/mL,比Vc低。

圖5 EPS和Vc的·OH清除率Fig.5 ·OH scavenging activity of EPS and Vc

圖6 EPS和Vc的清除率 scavenging activity of EPS and Vc

3 結(jié)論