王小蕾，林健，楊志遠(yuǎn)，劉立新，段會娟，程慧敏，趙際成，潘潔，劉月煥

鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗血清學(xué)試驗與免疫攻毒保護試驗的相關(guān)性

王小蕾，林健，楊志遠(yuǎn)，劉立新，段會娟，程慧敏，趙際成，潘潔，劉月煥

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

【】評價鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗2種效力評價方法平行關(guān)系，為采用血清學(xué)檢驗技術(shù)替代鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗本動物攻毒效力檢驗奠定基礎(chǔ)。3批疫苗實驗室制品分別以0.15、0.3、0.5、1.0 mL經(jīng)肌肉注射途徑免疫51日齡青年鴨和260日齡產(chǎn)蛋鴨，首次免疫后14 d，按相同的劑量和途徑進行二次免疫。二免后28日采血，分離血清并測定血清的HI抗體效價，根據(jù)抗體效價對試驗鴨分組，并分別經(jīng)肌肉注射途徑接種0.5 mL（100 DID50）的鴨坦布蘇病毒。攻毒后2 d采血，分離病毒，產(chǎn)蛋鴨攻毒后8 d剖檢，觀察卵巢病變。比較和分析HI抗體效價和攻毒保護結(jié)果的相關(guān)性。免疫青年鴨HI抗體效價≤1﹕5、1﹕10、1﹕20、1﹕40、1﹕80、1﹕160、1﹕320、1﹕640組保護率分別為50%（20/40）、43.8%（7/16）、74.3%（26/35）、86.7%（26/30）、96.6%（57/59）、92.7%（51/55）、95%（38/40）和100%（11/11），HI抗體效價低于1﹕20時攻毒保護率為48.2%，效價1﹕20時攻毒保護率為74.3%，效價1﹕40及以上時攻毒保護率達(dá)93.8%。免疫產(chǎn)蛋鴨HI抗體效價≤1﹕5、1﹕20、1﹕40和1﹕80組保護率分別為66.7%（12/18）、83.3%（10/12）、95.2%（20/21）和100%（15/15）；HI抗體效價1﹕10、1﹕160、1﹕320和1﹕640組保護比例分別為2/3、7/7、1/1和2/2；HI抗體效價為1﹕10及以下時攻毒保護率為66.7%，效價1﹕20時攻毒保護率為83.3%，效價1﹕40及以上時攻毒保護率達(dá)97.8%。青年鴨和產(chǎn)蛋鴨的HI抗體效價與攻毒保護率之間均有極顯著的正相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.905（<0.01）和0.932（<0.01）。鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）免疫后HI抗體與攻毒保護率存在正相關(guān)，可替代免疫攻毒法用于鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗的效力評價，初步將HI抗體效價1﹕20定為鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗免疫后產(chǎn)生抗體保護的標(biāo)準(zhǔn)。

鴨坦布蘇病毒；HI試驗；抗體效價；免疫攻毒；相關(guān)性

0 引言

【研究意義】鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起的、近年來國內(nèi)流行的、急性、高度接觸性的一種新型鴨傳染病[1-3]。該病2010年春夏首次在浙江暴發(fā)，隨后迅速蔓延至福建、上海、江西、安徽、山東、河北、河南、北京等多個養(yǎng)鴨地區(qū)，多個品種的鴨發(fā)病[4-5]，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大損失。疫苗免疫接種是控制傳染病最為經(jīng)濟和有效的措施之一。我國研究人員在疫苗的研究方面開展了大量的研究工作，先后研制成鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗和活疫苗[6-9]?，F(xiàn)有的鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）的效力評價方法為本動物免疫攻毒法（病毒分離法和產(chǎn)蛋鴨卵巢病理變化檢查法），該方法存在過程繁雜、檢驗周期長、使用負(fù)壓動物舍成本高等缺點。對禽流感、新城疫等多種疫苗的研究證實，動物免疫后的血清抗體效價與攻毒保護具有相關(guān)性[10-16]，因而血清學(xué)檢測方法是效力檢驗免疫攻毒法的替代方法之一。血凝抑制（Hemagglutination Inhibition test，HI）試驗是常用的血清學(xué)檢測方法之一，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便快速、成本較低、便于推廣應(yīng)用，在禽流感、新城疫等病毒的抗體檢測中有廣泛應(yīng)用[17-18]。中國獸藥典收錄的雞新城疫、減蛋綜合征、禽流感滅活疫苗組分的血清學(xué)效力檢驗也采用HI效價測定[19]。目前尚無用于評價鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）效力的血清學(xué)方法。將HI方法應(yīng)用于鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）免疫抗體的測定，研究HI抗體效價與疫苗免疫保護效果的相關(guān)性，以期用HI抗體效價測定法替代疫苗現(xiàn)有的本動物免疫攻毒效力檢驗方法，具有重要的應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M展】鴨坦布蘇病毒為黃病毒科黃病毒屬成員[20]。在血清學(xué)抗體檢測技術(shù)方面，已有鴨坦布蘇病毒ELISA抗體檢測方法的研究[21-23]和一種用于快速檢測抗體的乳膠凝集診斷方法[24]。黃病毒屬的成員多數(shù)具有血凝性[25]，鴨坦布蘇病毒經(jīng)蔗糖-丙酮處理后具有血凝性，可用于血凝抑制試驗。筆者前期建立了鴨坦布蘇病毒HI抗體檢測方法[26]。【本研究切入點】鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）免疫鴨后，利用前期研制的HI抗原測定血清中的HI抗體，將不同抗體效價的鴨分組并進行攻毒，通過攻毒保護的結(jié)果分析HI抗體效價和攻毒保護的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】HI抗體效價測定法能否替代免疫攻毒法用于鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗的效力評價。

1 材料與方法

本研究于2016年2月至2017年8月在北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 疫苗 鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株），批次見表1。

1.1.2 病毒 鴨坦布蘇病毒HB株（DTMUV-HB）F4代，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存，DID50為107.7/0.5mL。

1.1.3 鴨坦布蘇病毒血凝抑制試驗抗原 由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所研制，相關(guān)試劑由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.1.4 實驗動物 6—8周齡北京鴨，購自北京南口北京鴨育種中心；產(chǎn)蛋櫻桃谷鴨（約260日齡），購自河北安新某鴨場。免疫前DTMUV HI抗體均為陰性。

1.1.5 6日齡SPF雞胚 購于北京勃林格殷格翰實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.6 鵝紅細(xì)胞 采自北京周邊養(yǎng)殖場的健康鵝。

1.1.7 96孔U型微量板 購自Greiner公司。

1.1.8 負(fù)壓動物舍 由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司提供，實驗動物許可證SYXK（冀）2015-0045。

1.2 分組、免疫及攻毒

試驗鴨用芯片標(biāo)記，各批疫苗分別以0.15、0.3、0.5或1.0 mL/只的劑量經(jīng)胸部肌肉接種，設(shè)相同日齡的非免疫對照組。疫苗首次免疫后14 d，按照相同劑量和方法進行二次免疫，二次免疫后28 d采血，同時攻毒，每只鴨注射DTMUV-HB病毒液0.5 mL（含100個DID50）。試驗鴨免疫后飼養(yǎng)在北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)某鴨場，攻毒前運至瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司。各批疫苗分次進行試驗（表1）。

表1 免疫疫苗批次、劑量與免疫數(shù)量

1.3 病毒分離

攻毒后2日采血，分離血清，用于病毒分離。以每胚0.1 mL的劑量經(jīng)卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，每只鴨血清接種5枚雞胚，接種后24 h死亡的雞胚棄去，將接種后24—72 h死亡的雞胚且DTMUV核酸RT-PCR陽性胚判為DTMUV感染死亡雞胚。只要有1枚雞胚感染，即判這只鴨病毒分離陽性，為發(fā)病鴨。

1.4 鴨坦布蘇病毒的RT-PCR檢測

采用RNAiso Plus（寶生物工程（大連）有限公司）從死亡雞胚中按說明書提取RNA，使用TakaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0（寶生物工程（大連）有限公司）進行RT-PCR檢測，理論擴增片段長度988 bp。引物序列如下：

DTMUV-F: 5′-TCA AGG AAC TCC ACA CAT GAG ATG TAC T -3′；

DTMUV-R: 5′-GTG TCC CAT CCT GCT GTG TCA TCA GCA TAC A-3′。

1.5 卵巢病理變化觀察

產(chǎn)蛋鴨攻毒后8 d剖檢，觀察卵巢病理變化。卵泡具有變形或出血病變之一，判為病變卵泡。輸卵管內(nèi)無蛋且有3個及以上病變卵泡，判為病變卵巢。遇到卵泡數(shù)低于3個的鴨，如有病變卵泡，也判為病變卵巢。出現(xiàn)病變卵巢的鴨判為發(fā)病[27]。

1.6 HI抗體測定

血清前處理及HI操作方法見文獻(xiàn)[26]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將每只鴨的HI抗體效價和攻毒保護情況（病毒分離結(jié)果或卵巢病理變化觀察結(jié)果）進行一一對應(yīng)，統(tǒng)計不同HI抗體效價對應(yīng)的保護率，通過SPSS 20采用spearman相關(guān)系數(shù)分析HI抗體效價和攻毒保護率的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 青年鴨

免疫鴨的血清病毒分離結(jié)果陰性判為保護。剔除試驗過程中意外死亡或未分離出血清進行病毒分離的實驗鴨，共有286只免疫鴨的結(jié)果可用。各批次疫苗免疫青年鴨HI抗體效價與攻毒保護的結(jié)果見表2，抗體在≤1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640時保護率分別為50%（20/40）、43.8%（7/16）、74.3%（26/35）、86.7%（26/30）、96.6%（57/59）、92.7%（51/55）、95% (38/40)和100% （11/11）。對照組總發(fā)病率為100%（40/40）。對青年鴨HI抗體效價與攻毒保護率進行相關(guān)性分析，HI抗體與保護率的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.905 （＜0.01），說明兩者呈極顯著正相關(guān)。青年鴨免疫后HI抗體效價低于1:20時攻毒保護率僅為48.2%（27/56），效價1:20時攻毒保護率為74.3%（26/35），效價1:40及以上時攻毒保護率達(dá)93.8%（183/195）。

2.2 產(chǎn)蛋鴨

剔除試驗過程中意外死亡及非產(chǎn)蛋期鴨（產(chǎn)蛋停止期），共有79只免疫鴨的結(jié)果可用。匯總各批次疫苗免疫產(chǎn)蛋鴨的HI抗體效價與攻毒保護結(jié)果（表2），HI抗體效價≤1:5、1:20、1:40和1:80組保護率分別為66.7%（12/18）、83.3%（10/12）、95.2%（20/21）和100%（15/15）；HI抗體效價1:10、1:160、1:320和1:640組保護比例分別為2/3、7/7、1/1和2/2。對照組總發(fā)病率為90%（18/20）。對產(chǎn)蛋鴨HI抗體效價與攻毒保護率進行相關(guān)性分析，兩者的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.932（＜0.01），表明兩者有極顯著正相關(guān)。產(chǎn)蛋鴨免疫后HI抗體效價為1:10及以下時攻毒保護率為66.7%（14/21），效價1:20時攻毒保護率為83.3%（10/12），效價1:40及以上時攻毒保護率達(dá)97.8%（45/46）。

表2 青年鴨、產(chǎn)蛋鴨HI抗體效價及攻毒保護結(jié)果

A為免疫保護的只數(shù)，B為總只數(shù)

A is the number of immunoprotection, B is the total number

3 討論

在獸用疫苗免疫效力的各種評價方法中，基于免疫學(xué)原理的動物免疫攻毒法等動物試驗法仍然是最令人信服的評價方法。據(jù)統(tǒng)計《中國獸藥典( 2010年版)》中收載的80個獸用疫苗（40個活疫苗和40個滅活疫苗）中，用動物進行安全或效力檢驗的產(chǎn)品為100%。但是由于動物試驗法存在動物供應(yīng)不足（尤其是大動物和特殊要求的動物）、動物標(biāo)準(zhǔn)不完善致使質(zhì)量無法保證、免疫攻毒試驗過于頻繁存在生物安全隱患等問題，國家鼓勵采用疫苗本動物免疫攻毒效力檢驗的方法對疫苗進行效力評價[28]。疫苗本動物免疫攻毒效力檢驗的替代技術(shù)是獸用生物制品科技創(chuàng)新的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)容之一，目前應(yīng)用較多的替代方法主要有實驗動物替代法、血清學(xué)替代法（體內(nèi)和體外）和疫苗抗原定量法[29-30]。對于滅活疫苗，免疫動物后采集免疫血清測定其中特異性抗體滴度的效力檢驗方法研究相對較多，對禽流感、新城疫、口蹄疫等多種滅活疫苗的研究證實，動物免疫后的血清抗體效價與攻毒保護具有相關(guān)性[14-16, 31]。前期筆者研制成鴨坦布蘇病毒HI試驗抗原并建立了鴨坦布蘇病毒HI抗體檢測方法，該方法敏感性和特異性高，操作方便，結(jié)果易于判讀，可以定量檢測抗體效價。這為利用HI方法進行鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）的效力評價奠定了基礎(chǔ)。

本研究測定了疫苗免疫青年鴨和產(chǎn)蛋鴨后產(chǎn)生的HI抗體效價，根據(jù)抗體效價對免疫鴨分組并進行攻毒。青年鴨HI抗體效價與攻毒保護率之間的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.905（＜0.01）；免疫后HI抗體低于1:20時攻毒保護率為48.2%；效價1:20時攻毒保護率為74.3%；效價1:40及以上時攻毒保護率為93.8%。產(chǎn)蛋鴨的HI抗體效價與攻毒保護率之間的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.932（＜0.01）；免疫后HI抗體效價在1:10及以下時攻毒保護率為66.7%；效價1:20時攻毒保護率為83.3%；效價1:40及以上時攻毒保護率達(dá)97.8%。試驗結(jié)果表明，青年鴨和產(chǎn)蛋鴨的HI抗體效價與攻毒保護率之間均有極顯著的正相關(guān)性。個別HI抗體效價高的試驗鴨攻毒后發(fā)病，分析可能與鴨個體差異有關(guān)。同禽流感和新城疫等疫苗采用HI抗體效價測定方法一樣，鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗效力評價也可以用測定HI抗體效價方法替代本動物免疫攻毒法。初步將HI抗體效價1:20定為鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗免疫后產(chǎn)生抗體保護的標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗（HB株）免疫后HI抗體與攻毒保護率之間存在正相關(guān)性，HI抗體效價測定法可替代免疫攻毒法用于鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗的效力評價。

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Correlation Research of the Serological Test (HI) and Challenge Test of Duck Tembusu Virus Inactivated Vaccine

WANG XiaoLei, LIN Jian, YANG ZhiYuan, LIU LiXin, DUAN HuiJuan, CHENG HuiMin, ZHAO JiCheng, PAN Jie, LIU YueHuan

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agricultural and ForestrySciences, Beijing 100097)

【】The objective of this paper was to evaluate the correlation of the serological test (HI) and challenge test of duck Tembusu virus inactivated vaccine.【】Three batches of vaccines ( laboratory trial products) were used to immunize the 51-day-old young ducks and 260-day-old laying ducks by intramuscular injection in 0.15, 0.3, 0.5 and 1.0 mL, respectively. Secondary immunization was proceeded in the same doses and route at 14 day after primary immunization. Ducks were regrouped according to the HI titer and challenged with 0.5 mL (100 DID50) DTMUV at day 28 after secondary immunization. Serum samples were collected at 2 days later for virus isolation and laying ducks were dissected at 8 days later to observe the ovarian lesions. All the results were counted to evaluate the immune potency of vaccines. The correlation of HI titer and immune protection rate was analyzed.【】The protection rate of immunized young ducks with HI titer of 1:5 or lower, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 was 50% (20/40), 43.8% (7/16), 74.3% (26/35), 86.7% (26/30), 96.6% (57/59), 92.7% (51/55), 95% (38/40) and 100% (11/11), respectively. The protection rate was 48.2% with HI titer lower than 1:20, while the rate was 74.3% with HI titer of 1:20 and 93.8% with HI titer of 1:40 or greater. In laying ducks, the protection rate of flocks with HI titer of 1:5 or lower, 1:20, 1:40 and 1:80 was 66.7% (12/18), 83.3% (10/12), 95.2% (20/21) and 100% (15/15), respectively. The protected proportion of ducks with HI titer of 1:10, 1:160, 1:320 and 1:640 was 2/3, 7/7, 1/1 and 2/2, respectively. The protection rate was 66.7% with HI titer of 1:10 or below, while the rate was 83.3% with HI titer of 1:20 and 97.8% with HI titer of 1:40 or greater. There were significant positive correlations between the HI titer and the immune protection rate both in young ducks and laying ducks. The Spearman’s correlation coefficient was 0.905 (＜0.01) and 0.932 (＜0.01), respectively. 【】There were positive correlations between the HI titer and the immune protection rate of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB). The HI detection could be used to evaluate the efficacy of duck Tembusu virus inactivated vaccine (strain HB) instead of challenge test. The HI titer of 1:20 could be defined as the criteria of protection for the duck Tembusu virus inactivated vaccine after immunization.

duck Tembusu virus; HI test; antibody titer; challenge; correlation

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.023

2019-04-17；

2019-08-23

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0500800）、北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（QNJJ201730）

王小蕾，E-mail：wangxl227@126.com。

劉月煥，E-mail：liuyuehuan@sina.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）