趙琳琳 陳 瑋

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所，杭州 310058)

三結(jié)構(gòu)域蛋白 21(tripartite motif 21，TRIM21)又名Ro52/SS-A，早期作為自身抗原在自身免疫疾病中被廣泛探究[1]。研究發(fā)現(xiàn)其是一種E3泛素連接酶，并在機(jī)體組織中廣泛表達(dá)。TRIM21屬于TRIM(tripartite motif)蛋白家族，其家族成員約有100個(gè)[2]。已有報(bào)道表明許多TRIM蛋白參與機(jī)體發(fā)生免疫調(diào)節(jié)和抗微生物感染的過程，調(diào)控與抗病毒細(xì)胞因子相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。令人感興趣的是TRIM21 也在先天抗病毒免疫方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與此同時(shí)，其作為E3泛素連接酶的結(jié)構(gòu)和功能也逐漸被揭開神秘的面紗。

1 TRIM21的蛋白結(jié)構(gòu)

TRIM21的分子量是52 kD，與大多數(shù)TRIM蛋白一樣，較多分布于胞質(zhì)內(nèi)，少部分存在于細(xì)胞核。TRIM21是多結(jié)構(gòu)域蛋白，由RING-finger結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域、卷曲結(jié)構(gòu)域和PRYSPRY 結(jié)構(gòu)域組成。RING-finger結(jié)構(gòu)域是TRIM21蛋白N端的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域中，由半胱氨酸和組氨酸殘基形成鋅離子結(jié)合位，是TRIM21作為E3泛素連接酶發(fā)揮功能的基礎(chǔ)[3]。B-box 結(jié)構(gòu)域是和鋅離子配位的又一功能結(jié)構(gòu)域，約由40個(gè)氨基酸殘基組成，該結(jié)構(gòu)域由3條β折疊股和1個(gè)α螺旋片段組成，其空間構(gòu)象與RING-finger結(jié)構(gòu)域相仿[4]。在TRIM21發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能時(shí)，B-box結(jié)構(gòu)域通過自身抑制的方式與 E2 泛素結(jié)合酶競(jìng)爭(zhēng)RING-finger中的結(jié)合位點(diǎn)，模擬E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶的相互作用過程，從而抑制TRIM21蛋白的泛素酶活性[3]。卷曲結(jié)構(gòu)域可由多個(gè)α螺旋相互纏繞形成二聚體或高級(jí)結(jié)構(gòu)，可促進(jìn) TRIM21 分子的同源二聚化，幫助其定位其他結(jié)構(gòu)域，從而形成穩(wěn)定的大分子聚合體[5]。此外，卷曲結(jié)構(gòu)域還參與TRIM21對(duì)底物的識(shí)別和泛素化的過程。位于C端的 PRYSPRY 結(jié)構(gòu)域是一個(gè)類球形的三維立體折疊結(jié)構(gòu)，其中包含1個(gè)由2個(gè)反向平行的 β 折疊組成的扭曲 β-三明治結(jié)構(gòu)[6]。該結(jié)構(gòu)包含抗體結(jié)合位點(diǎn)，并且決定了配體的特異性和功能。另外，最新發(fā)現(xiàn)PRYSPRY結(jié)構(gòu)域可以與具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)結(jié)合，是TRIM21 在抗病毒免疫方面的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。

2 TRIM21在抗病毒免疫信號(hào)通路中的功能

作為抵抗外源微生物入侵的第一道防線，先天免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體(pattern recognization recptors，PRRs)識(shí)別外源微生物的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，激活先天免疫應(yīng)答信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素和炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而抵抗外源微生物的入侵。TRIM21 作為E3泛素連接酶,廣泛參與先天免疫信號(hào)通路中細(xì)胞因子的調(diào)控過程，其獨(dú)特的泛素化形式和功能一直被人們廣泛探究。

2.1TRIM21的自身泛素化 泛素化修飾是機(jī)體非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的形式之一，與機(jī)體的各項(xiàng)生理活動(dòng)息息相關(guān)。泛素化循環(huán)涉及4種酶：E1泛素激活酶，E2泛素結(jié)合酶，E3泛素連接酶和DUB(泛素去泛素化酶)。泛素化有單泛素化和多泛素化兩種形式。多泛素化主要通過泛素分子上7個(gè)不同的賴氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中 K48 泛素化和K63 泛素化的相關(guān)研究最受矚目。眾所周知，K48連接的泛素鏈可以被蛋白酶體識(shí)別，從而引發(fā)被修飾底物的降解；而K63連接的泛素鏈更多的是在激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路這一過程發(fā)揮功能[7]。因此，具有E3泛素連接酶功能的TRIM蛋白能通過催化不同類型的泛素化而在抗病毒免疫信號(hào)通路中發(fā)揮不同的功能。

Wada等早期研究TRIM21是否具有同TRIM家族其他蛋白相同的E3泛素連接酶特性時(shí)，曾將TRIM21作為泛素化的E3連接酶與純化后的E1激活酶和不同的E2結(jié)合酶(UbcH2,UbcH5,UbcH7,UbcH10和hCDC34)共孵育,在泛素和ATP存在的條件下，發(fā)現(xiàn)TRIM21 與E2酶UbcH5作用后，可與K48泛素鏈發(fā)生自體泛素化，證明了TRIM21是E3泛素連接酶，并且此種泛素化主要以單體形式存在，并不通過蛋白酶體相關(guān)通路降解。

對(duì)TRIM家族其他蛋白的相關(guān)研究顯示，許多TRIM蛋白可泛素化其底物從而調(diào)節(jié)或維持底物的穩(wěn)定性，而通過K63多泛素連接的信號(hào)蛋白，往往在免疫防御調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，TRIM21要想發(fā)揮抗病毒功能，其與K63泛素化的相互作用過程是不可或缺的，而這種結(jié)合是由泛素結(jié)合酶E2的順序活性決定的。TRIM21首先被E2酶Ube2W標(biāo)記為單泛素分子(monoubiquitin，monub)，單泛素化的TRIM21又是E2酶Ube2N/Ube2V2的底物，故Ube2N/Ube2V2進(jìn)一步促進(jìn)了TRIM21的K63連接的泛素化過程[8-10]，以上研究表明，TRIM21的逐步激活需要兩種不同的E2酶Ube2W和Ube2N/Ube2V2；并且，當(dāng)E2酶缺失時(shí)，TRIM21與K48、K63的泛素化結(jié)合過程將發(fā)生中斷，TRIM21自身參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒內(nèi)化等過程均不能進(jìn)行。在TRIM21的泛素化循環(huán)過程中，POH1作為一種與TRIM21發(fā)揮中和病毒、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)功能相關(guān)的去泛素化酶，對(duì)泛素鏈的降解起著重要作用，它抑制TRIM21在抗病毒先天免疫信號(hào)中的泛素化作用。有研究報(bào)道，在正常機(jī)體組織中，TRIM21參與NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而POH1缺失的細(xì)胞不能發(fā)生這一過程，這恰恰證明POH1可阻斷TRIM21 與K63連接的泛素鏈，從而激活抗病毒先天免疫信號(hào)通路[9]。對(duì)去泛素化酶POH1的研究進(jìn)一步揭示了TRIM21激活的復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制，尤其對(duì)于在沒有感染的情況下控制異常信號(hào)，防止機(jī)體發(fā)生不必要的炎癥反應(yīng)是至關(guān)重要的。

2.2TRIM21與抗病毒相關(guān)傳感器作用 人體細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫傳感器，可以檢測(cè)胞質(zhì)中病毒核酸的存在。然而，幾乎所有的病毒都有蛋白質(zhì)外殼來(lái)保護(hù)它們的基因組，因此在病毒基因組必須暴露在胞質(zhì)中的情況下，非結(jié)構(gòu)病毒蛋白就可以在蛋白衣殼分解過程中隱藏基因組使其不被檢測(cè)到。Kutluay等人先前的研究表明，TRIM5α可通過蛋白酶體降解途徑，降解進(jìn)入胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒從而導(dǎo)致病毒核酸的暴露[8]；無(wú)獨(dú)有偶，TRIM21在抗體介導(dǎo)的中和反應(yīng)下，通過ATPase p97/valosin-containing protein (VCP)和蛋白酶體使外來(lái)病毒的蛋白衣殼分解，同時(shí)將其基因組暴露給核酸傳感器，從而在病毒基因組復(fù)制開始之前搶先激活免疫轉(zhuǎn)錄功能[11]。此時(shí)，TRIM21通過胞質(zhì)中的核酸感受器cGAS和RIG-Ⅰ，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)抗體結(jié)合的DNA或RNA病毒的感知和檢測(cè)[12]。上述研究表明TRIM21通過對(duì)進(jìn)入胞漿的病毒顆粒的感知而不是對(duì)子代基因組的感知，進(jìn)而協(xié)調(diào)機(jī)體完成感染時(shí)的快速免疫應(yīng)答過程。與上述TRIM21促進(jìn)機(jī)體抗病毒的研究相反的是，最近研究發(fā)現(xiàn)TRIM21可與機(jī)體新型DNA感受器DDX41結(jié)合，以K48連接的泛素化形式作用于DDX41的賴氨酸9位和115位，促使DDX41通過泛素化-蛋白酶體途徑降解，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，協(xié)調(diào)機(jī)體發(fā)揮抗病毒功能[13，14]。

2.3TRIM21與MAVS的相互作用 一直以來(lái)，線粒體適配器分子MAVS在機(jī)體對(duì)病毒感染的天然免疫應(yīng)答中占有重要地位。已經(jīng)報(bào)道的一些E3連接酶，如AIP4 (atrophin-1 interacting protein 4)，RNF5(ring finger protein 5)，Smurf1(smad ubiquitin regulator factor 1)，TRIM25 和March5(membrane-associated RING-CH protein 5)等都能催化MAVS發(fā)生K48連接的泛素化，并促進(jìn)MAVS進(jìn)一步降解，從而負(fù)性調(diào)節(jié)MAVS的活性。而最新的研究發(fā)現(xiàn)E3泛素化連接酶TRIM21與MAVS發(fā)生相互作用，可正向調(diào)節(jié)MAVS的活性，增強(qiáng)先天固有免疫反應(yīng)。此項(xiàng)研究表明TRIM21通過催化MAVS發(fā)生K27位的泛素化，進(jìn)一步促進(jìn)TBK1被招募到MAVS，從而激活下游抗病毒信號(hào)通路。其中，TRIM21的PRYSPRY結(jié)構(gòu)域是其與MAVS相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，而TRIM21的RING-finger結(jié)構(gòu)域則促進(jìn)了MAVS的泛素鏈的形成。并且對(duì)MAVS所有賴氨酸殘基的突變分析進(jìn)一步表明MAVS的賴氨酸325位是TRIM21催化的K27連接的泛素化位點(diǎn)[15]。綜上所述，盡管研究報(bào)道的大多E3泛素連接酶負(fù)向調(diào)節(jié)MAVS的抗病毒活性，但TRIM21促進(jìn)MAVS的K27連接的泛素化可正向調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答，從而抑制病毒感染[16]。

2.4TRIM21與IRF的相互作用 病毒感染后天然免疫反應(yīng)的核心是機(jī)體產(chǎn)生Ⅰ型干擾素并建立抗病毒狀態(tài)。當(dāng)病毒入侵機(jī)體時(shí)PRRs對(duì)病毒感染作出反應(yīng)，誘導(dǎo)大量的Ⅰ型IFN發(fā)揮強(qiáng)大的抗病毒效應(yīng)。這一過程離不開一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，即干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors,IRFs)。IRFs由Ⅰ型IFN或PAMPs誘導(dǎo)，并在機(jī)體中受其調(diào)控，可引起下游信號(hào)的激活。由于TRIM21本身在轉(zhuǎn)錄水平上受IRFs調(diào)節(jié)，故在機(jī)體發(fā)生抗病毒防御反應(yīng)和自身免疫疾病期間，IRF1和IRF2可誘導(dǎo)TRIM21表達(dá)[17]。隨后，被誘導(dǎo)表達(dá)的TRIM21在TLRs的刺激下與IRF3、IRF5、IRF7和IRF8相互作用，介導(dǎo)其發(fā)生泛素化，隨后降解，從而終止信號(hào)傳導(dǎo)[18,19]。雖然已有許多文獻(xiàn)報(bào)道稱TRIM21是IRFs的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，但從最近的研究成果綜合來(lái)看，這一說法并不準(zhǔn)確。目前更可能的猜想認(rèn)為：在靜息細(xì)胞和免疫反應(yīng)的早期，TRIM21可能起到增強(qiáng)IRF3和IRF8轉(zhuǎn)錄活性的作用，然而隨后又與其他因素協(xié)同作用，在信號(hào)晚期降解IRFs。

2.4.1TRIM21對(duì)IRF3的復(fù)雜調(diào)控 IRF3是促進(jìn)Ⅰ型干擾素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在抗病毒免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IRF3與TRIM21的作用和聯(lián)系一直備受關(guān)注，有許多報(bào)道對(duì)此進(jìn)行過深入研究。在這些研究中Higgs等[20]提出的TRIM21是IRF3依賴的Ⅰ型干擾素的負(fù)調(diào)節(jié)因子這一觀點(diǎn)被大家廣泛接受。他們發(fā)現(xiàn)機(jī)體被RNA病毒感染后，TRIM21被顯著誘導(dǎo)，其C-末端PRYSPRY結(jié)構(gòu)域與IRF3結(jié)合產(chǎn)生相互作用，促進(jìn)了IRF3的K48位的泛素化和降解。并且，TRIM21對(duì)IRF3誘導(dǎo)的干擾素-β也起抑制作用，而這種作用又可被蛋白酶體抑制劑MG132顯著逆轉(zhuǎn)，表明TRIM21介導(dǎo)的IRF3泛素化和降解的直接結(jié)果是抑制干擾素-β的產(chǎn)生。此外，Gunjan等[21]發(fā)現(xiàn)，在乙型腦炎病毒感染人小膠質(zhì)細(xì)胞的過程中，TRIM21表達(dá)增多，并通過IRF-3下調(diào)IFN-β，從而在感染早期抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)。Espinosa[22]和Yoshimi等[23]研究也證實(shí)了IRF3、IRF5、IRF8作為TRIM21 的底物被多泛素化降解從而抑制IFNs活性的觀點(diǎn)。然而Yang等發(fā)現(xiàn)，TRIM21是維持IRF3穩(wěn)定表達(dá)并發(fā)揮功能的正向調(diào)節(jié)劑。他們證實(shí)機(jī)體在感染RNA病毒時(shí)，TRIM21被顯著誘導(dǎo)并與IRF3相互作用，異位表達(dá)或敲除TRIM21可分別增強(qiáng)或削弱IRF3介導(dǎo)的基因的表達(dá)。以上兩種觀點(diǎn)截然相反，Yang對(duì)此的解釋是，IRF3有可能與一種未知的蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，該蛋白質(zhì)正是TRIM21的泛素化目標(biāo)。先前有報(bào)道稱肽酰-脯氨酰異構(gòu)酶Pin1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，NIMA-Interaction 1)與磷酸化的IRF3相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)其降解，Pin1本身并不直接催化IRF3發(fā)生泛素化[24]。而對(duì)TRIM21的研究發(fā)現(xiàn)，其可干擾Pin1與IRF3相互作用，從而阻止IRF3的泛素化和降解。這一發(fā)現(xiàn)或許可以從側(cè)面證實(shí)Yang等人的觀點(diǎn)。還有部分研究表明TRIM21的磷酸化修飾在其與IRF3發(fā)生相互作用的過程中也產(chǎn)生舉足輕重的影響。TRIM21的PRYSPRY結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸393磷酸化可正向調(diào)節(jié)其自身活性，若將酪氨酸393突變?yōu)楸奖彼釙?huì)導(dǎo)致TRIM21的活性喪失，并降低其與底物IRF3相互作用的能力[25]。

2.4.2TRIM21對(duì)IRF5的負(fù)調(diào)控作用 已知在TRIM21-/-小鼠中其SLE癥狀加重，其特征是促炎細(xì)胞因子如I型干擾素，IL-12和IL-23等的產(chǎn)生增強(qiáng)，而這些細(xì)胞因子受IRF家族的調(diào)控，有學(xué)者認(rèn)為SLE 的疾病發(fā)生是由于SLE患者中IRF5-TRIM21調(diào)節(jié)環(huán)失調(diào)[26]。Elisa等[27]研究結(jié)果認(rèn)為識(shí)別RNA和DNA的核酸感受器TLR7和TLR9可參與SLE中自身抗體和I型干擾素的產(chǎn)生過程。在TLR7受到刺激后，TRIM21中的C-末端PRYSPRY結(jié)構(gòu)域可與IRF5結(jié)合，發(fā)生泛素化并促進(jìn)IRF5的降解，從而負(fù)向調(diào)控I 型干擾素的產(chǎn)生。在此過程中，IRF5的C-末端IAD結(jié)構(gòu)域中保守的絲氨酸殘基磷酸化后發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步促進(jìn)IRF5和TRIM21之間的結(jié)合[18]。與之相近的是，在輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1刺激下，IRF3和IRF7的IAD結(jié)構(gòu)域必須是完整的才能發(fā)生泛素化和降解。這表明這個(gè)保守的公共區(qū)域可能會(huì)在機(jī)體被外來(lái)病毒刺激的條件下，充當(dāng)E3泛素連接酶的作用位點(diǎn)，從而泛素化IRF并終止IRF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)[28]。因此可以大膽推測(cè)：IRF蛋白的IAD結(jié)構(gòu)域可能是TRIM21介導(dǎo)的該家族轉(zhuǎn)錄因子降解的共同靶點(diǎn)。

2.4.3TRIM21對(duì) IRF7 的負(fù)調(diào)控作用 同為IRF家族的一員，IRF7與IRF3具有許多相似的功能。Higgs等人揭示了TRIM21對(duì)IRF3介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控功能后，又證實(shí)TRIM21在調(diào)節(jié)IRF7的穩(wěn)定性和活性方面，與其對(duì)IRF3的調(diào)節(jié)相類似，即當(dāng)TLR7和TLR9受到刺激后，TRIM21介導(dǎo)的K48泛素化促進(jìn)了IRF7的降解，從而負(fù)向調(diào)節(jié)IFN的產(chǎn)生。

Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain,FADD)最初被描述為一種凋亡蛋白，通過與TRIM21相互作用，可增強(qiáng)TRIM21的泛素化活性，但TRIM21沒有使FADD本身發(fā)生泛素化，而是協(xié)同作用于IRF7使其泛素化，從而抑制IFN-α的產(chǎn)生[29]。即FADD和TRIM21可一同負(fù)調(diào)節(jié)晚期IFN-α以響應(yīng)病毒感染。

2.4.4TRIM21對(duì)IRF8早期的正調(diào)控作用 IRF8是一種調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育和功能的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)包括IL-12p40和Ⅰ型IFN在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。與其他IRFs不同，IRF8與TRIM21相互作用發(fā)生泛素化，其自身并沒有降解，而是表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄功能的增強(qiáng)，促進(jìn)了IL-12、IL-12p40的表達(dá)[30]。這一過程有助于激發(fā)巨噬細(xì)胞的先天免疫防御作用。此外，p62與TRIM21可協(xié)同調(diào)節(jié)IRF8的降解；然而p62又可促進(jìn)自噬形成和降解含多泛素化的蛋白復(fù)合物[18,31]。因此，可猜想雖然TRIM21介導(dǎo)的IRF8泛素化最初可以增強(qiáng)其活性，但在反應(yīng)后期與泛素化IRF8結(jié)合的p62又可能會(huì)促進(jìn)其降解。

以上多項(xiàng)研究結(jié)果顯示TRIM21通過與IRFs的泛素化作用對(duì)IFNs進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，從而在天然免疫、適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要的免疫防御功能。

3 TRIM21在機(jī)體中的其他抗病毒免疫功能

TRIM21作為中和病毒感染的“有效因子”，是目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)細(xì)胞漿內(nèi) IgG 受體[32-34]。與其他Fc受體相比，其具有廣泛的同型特異性，不僅與IgG結(jié)合，還與IgM和IgA結(jié)合[34]?？贵w是機(jī)體抗感染的關(guān)鍵分子，最近的研究發(fā)現(xiàn)：抗體介導(dǎo)的抗感染保護(hù)作用已延伸到細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)隔室。此種抗體進(jìn)入細(xì)胞后的病毒防御機(jī)制需要抗體與胞質(zhì)Fc受體結(jié)合，而TRIM21 正是在其中發(fā)揮作用的特異性胞質(zhì)Fc受體。當(dāng)被這些抗體亞型包被的病毒病原體進(jìn)入胞質(zhì)時(shí)，機(jī)體迅速招募TRIM21，從而使進(jìn)入機(jī)體中的病毒在大量復(fù)制之前就得到了有效的中和。此外，TRIM21可與補(bǔ)體系統(tǒng)協(xié)同作用，在補(bǔ)體因子C1/C4的參與下進(jìn)一步阻斷病毒復(fù)制[35,36]。

4 結(jié)語(yǔ)

TRIM21作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，為機(jī)體建立起一道抵抗病原體入侵的新防線。TRIM21充分發(fā)揮自身的E3泛素連接酶活性，在抗病毒天然免疫信號(hào)中參與體內(nèi)細(xì)胞因子的復(fù)雜而精密的調(diào)控過程，維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。 對(duì) TRIM21 抗病毒機(jī)制的研究不僅有助于更好地認(rèn)識(shí)自身免疫系統(tǒng)，同時(shí)也為一些腫瘤、病毒感染相關(guān)的疾病提供了臨床預(yù)防和診療的新思路。