何永玲 王彩梅 楊 峻 曾志能 喬永超 韋葉生

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，桂林 541000)

既往研究集中于探索編碼基因在疾病中的病理生理作用，隨著研究深入和技術(shù)進步，非編碼基因在疾病中的角色逐漸被重視，成為研究熱點[1,2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是由20～26個核苷酸構(gòu)成的高度保守的非編碼RNA，調(diào)控真核細胞的基因表達。研究表明，成熟的miRNA與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，抑制靶基因翻譯或涉及靶基因降解影響靶基因表達[3]。近年心腦血管疾病的發(fā)病率急劇上升，是當今全球高發(fā)病率及高病死率的疾病之一[4]。血脂是多種心腦血管疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)，早期預防和控制血脂異常是避免該類疾病發(fā)生的重要手段。miR-29b-2多態(tài)性與血脂的關(guān)系尚未見報道。因此，本文研究其多態(tài)性在不同人群間的差異，并進一步探討其和血脂的關(guān)系，以期指導地區(qū)血脂防控，減少以血脂為發(fā)病基礎(chǔ)的疾病發(fā)生，為疾病易感性預防研究的基因位點選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1資料 選取291名健康志愿者，均無心臟病史、中風和血脂異常等相關(guān)疾病。年齡18～79歲，均來自廣西地區(qū)，且無血緣關(guān)系。本研究經(jīng)我院倫理委員會獲批準，參與者知情同意。

1.2方法

1.2.1DNA抽提 取受試者靜脈血3 ml，DNA抽提試劑提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物合成 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索miR-29b-2基因rs1474742A/C和rs12401619C/G序列，Primer 3.0軟件設(shè)計引物。rs1474742A/C位點F：5′-AGAGGCCTGAAAGGAAGCTAAAATATACACTT-3′，R：5′-AGAGGCCTGAAAGGAAGCTAAAATATACACT-G-3′；rs12401619C/G位點F：5′-CAAGCACCCTATC-TGCCTGAGC-3′，R：5′-CAAGCACCCTATCTGCCTGA-GG-3′。

1.2.3基因型檢測 SNPscan法檢測基因型，連接酶連接反應的高特異性識別SNP位點等位基因，在連接探針末段引入不同長度的非特異序列及通過連接酶加接反應獲得位點對應的不同長度連接產(chǎn)物，標記熒光的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離，GeneMapper軟件分析各SNP位點的基因型。

1.2.4血脂水平檢測 受試者禁食并于清晨采集靜脈血3 ml，分離收集血清。生化分析儀分析血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)水平。

2 結(jié)果

2.1基因型結(jié)果 獲得基因型均符合Hardy-Weinberg定律(P>0.05)，證明所選人群具有代表性。rs1474742A/C具有AA、AC和CC 3種基因型，rs12401619C/G具有CC、CG和GG 3種基因型。

2.2廣西人群多態(tài)性與其他人群比較 廣西人群rs1474742A/C基因型和等位基因頻率與美國人、歐洲人、日本人、意大利人和中國漢族人相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；廣西人群rs12401619C/G基因型和等位基因頻率與美國人、歐洲人、日本人、意大利人和中國漢族人相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1、2。

表1 廣西人群miR-29b-2基因rs1474742A/C多態(tài)性與其他人群比較[5]Tab.1 Comparison of polymorphism of rs1474742A/C in miR-29b-2 gene between Guangxi population and other populations[5]

2.3基因型和血脂水平相關(guān)性分析 各位點的基因型、志愿者年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。rs12401619C/G位點GG和CG的各項血脂指標水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。rs1474742A/C位點AC/AA和CC在LDL-C中的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表2 廣西人群miR-29b-2基因rs12401619C/G多態(tài)性與其他人群的比較Tab.2 Comparison of polymorphism of rs12401619C/G in miR-29b-2 between Guangxi population and other populations

表3 miR-29b-2基因rs12401619C/G基因型的各項指標比較(mmol/L)Tab.3 Comparison of each item in genotypes of rs12401619C/G in miR-29b-2 gene(mmol/L)

表4 miR-29b-2基因rs1474742A/C基因型的各項指標比較(mmol/L)Tab.4 Comparison of each item in genotypes of rs1474742A/C in miR-29b-2 gene(mmol/L)

3 討論

miRNA的拷貝或基因簇等形式是其存在于基因組的生物學特點，屬于基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要因子。miRNA對靶基因的影響取決于互補程度，即miRNA和靶基因完全配對結(jié)合時，導致靶基因降解，不完全配對則抑制靶基因翻譯。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，其序列不同僅表現(xiàn)為少數(shù)堿基的差異，其靶基因參與細胞增殖、分化、凋亡和遷移等生物學活動[6]。動脈粥樣硬化表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞損壞，平滑肌增厚形成黃色或灰黃色，表現(xiàn)為斑塊，累及心臟、大腦和腎臟等器官，是引發(fā)心腦血管疾病的主要因素之一[7]。血脂水平促進動脈粥樣硬化斑塊形成，促使血液流變學產(chǎn)生變化，機體血液黏稠度增加，血管壁彈性降低，相關(guān)疾病發(fā)生風險增加[8,9]。研究發(fā)現(xiàn)血脂異常類疾病與遺傳背景差異相關(guān)。Pereira-da-Silva等[10]發(fā)現(xiàn)miR-29在頸動脈粥樣硬化中呈低表達。動脈粥樣硬化斑塊的異常重塑導致血管破裂、急性心肌梗死和死亡。ECM(Col1A和Col3A)的miR-29靶基因上調(diào)，導致病變范圍縮小，纖維帽厚度增強，壞死區(qū)域減小[11]。HFD小鼠內(nèi)皮細胞凋亡水平明顯升高，其原因為Bcl-2蛋白減少。Bcl-2水平下降是由于miR-29水平上調(diào)，抑制其mRNA通過3′-UTR結(jié)合的翻譯[12]。miR-29過表達可降低己糖激酶2表達和活性，負調(diào)控脂肪酸氧化，可能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物-1α表達[13]。劉穎等[14]在HepG2細胞系轉(zhuǎn)染miR-29b-3p后，在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上調(diào)ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)，而ABCA1是高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)合成調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白。ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中，動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生可能與動脈粥樣硬化晚期MMP-9表達上升和miR-29b表達下降相關(guān)[15]。提示miR-29b是參與血脂相關(guān)疾病的關(guān)鍵基因。因此，研究miR-29b-2基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)廣西人群的rs1474742A/C和rs12401619C/G基因型和等位基因頻率與美國人、歐洲人、日本人和意大利人差異具有統(tǒng)計學意義，提示廣西人群的多態(tài)性分布具有遺傳特征，可能與區(qū)域地理特點有關(guān)[16]。在基因多態(tài)性和血脂的關(guān)系分析中，rs1474742A/C位點的AC/AA和CC相比差異具有統(tǒng)計學意義，提示其可能影響血脂代謝。啟動子對基因的表達水平起重要調(diào)節(jié)作用，s1474742A/C位點位于miR-29b-2基因的啟動子區(qū)，可能影響其表達并影響血脂代謝途徑。因此，研究基因多態(tài)性和疾病關(guān)系時，此類單核苷酸位點是優(yōu)先參考的篩選位點。

綜上所述，探索廣西人群miR-29b-2基因的rs1474742A/C位點和rs12401619C/G位點的特征將為個體精準治療提供遺傳學基礎(chǔ)，充實我國群體基因型分布數(shù)據(jù)，為遺傳病研究及人類學研究提供準確完整的數(shù)據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)rs1474742A/C多態(tài)性與血脂水平相關(guān)，為血脂相關(guān)疾病研究奠定了基礎(chǔ)。本研究尚存在不足，如朝鮮族是北方重要少數(shù)民族，其與地處南方的廣西人群多態(tài)性分布是否具有差異尚未闡明，因此，本課題組下一步將開展針對我國不同地區(qū)人群多態(tài)性差異的比較研究并闡明其對血脂影響的分子機制。本研究將為多態(tài)性在更多人群的研究數(shù)據(jù)及對以血脂為基礎(chǔ)的疾病研究提供方向。