趙成基 李斌德 李 剛 王文赟 馬仲福 曾永娟 胡繼科

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院小兒外科，蘭州 730000)

膽道閉鎖(biliary atresia，BA)是一種僅見(jiàn)于嬰兒的膽管閉塞性疾病，其特征是膽道進(jìn)行性梗阻、肝纖維化和炎癥，若BA患兒前期接受積極治療則可以存活至成年[1]。統(tǒng)計(jì)顯示，BA的發(fā)病有明顯的地區(qū)與種族差異，相較于北美和西歐，其在亞洲的發(fā)病率明顯較高[2,3]。在臨床上，肝移植仍然是提高BA患兒存活率的主要治療手段，但至今為止BA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，增加了其治療的難度[4]。MicroRNA是內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，可以通過(guò)與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的翻譯和表達(dá)，從而參與多種生物學(xué)過(guò)程[5-7]。Peng等[8]在2016年的報(bào)道中表明，miR-122-5p在BA患兒血清中的表達(dá)顯著上調(diào)，且Gao等[9]的研究顯示miR-122-5p參與了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞模型，在體外探究miR-122-5p在BA中的作用機(jī)制，為后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 收集2018年1月至2018年12月間到本院就診并診斷為的BA的10例患兒血清，選取同期在本院診斷為非BA的9例患兒血清，基本信息見(jiàn)表1。所有參與本研究的患兒均征得監(jiān)護(hù)人同意且通過(guò)我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 BA及CC患兒臨床信息Tab.1 Clinical information in infants with BA and CC

1.1.2細(xì)胞與試劑 人源肝星形細(xì)胞LX-2購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司，貨號(hào)YCL-0560。胎牛血清和LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；TRIzol和RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天健生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimescripTMRT reagent Kit、miRNA PrimescripTMRT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司；引物委托Sangon Biotech設(shè)計(jì)并合成；青霉素和鏈霉素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、CCK-8和DMSO購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Kit購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將LX-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。待細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后將miR-122-5p mimics、Anti-miR-122-5p及pc-PPP2R2A按實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。用LipofectamineTM2000試劑盒按操作指導(dǎo)完成轉(zhuǎn)染。48 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-qPCR 使用TRIzol和RNA提取試劑盒提取總RNA。NanoDrop檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，統(tǒng)一稀釋為500 ng/μl。使用PrimescripTMRT試劑盒和miRNA PrimescripTMRT試劑盒將PPP2R2A mRNA及miR-122-5p的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒作為qPCR擴(kuò)增的模板。在LightCycle 96熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，共40個(gè)循環(huán)，退火，60℃延伸30 s。GAPDH用作mRNA內(nèi)參，U6用作miRNAs內(nèi)參，并使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.2.3Western blot 使用RIPA裂解液分離細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。將相同濃度的蛋白質(zhì)混合物在95℃下煮沸10 min。然后將20 μl的混合物(包含30～50 μg樣品)加入到含有10%聚丙烯酰胺凝膠的平板中，電泳分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，然后在4℃與一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜。樣品用TBST洗滌，然后與二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。β-actin或GAPDH用作內(nèi)參，用Image J測(cè)定條帶灰度，重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 先在不同分組下處理48 h，600 g離心5 min，棄上清并用PBS洗滌細(xì)胞1次，各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到6孔板中培養(yǎng)12 h，然后根據(jù)試劑盒的操作流程，使用Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Kit和流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理下細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3次。

1.2.5CCK-8 將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，孵育過(guò)夜。在經(jīng)過(guò)不同組處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，向各孔中加入CCK-8試劑10 μl，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下孵育30 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在450 nm處的吸光度(OD450)，使用CV=(試驗(yàn)OD450/對(duì)照OD450)×100% 計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism8軟件繪制相關(guān)統(tǒng)計(jì)圖和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-122-5p在BA患者及CC患者血清中的表達(dá) miR-122-5p在BA患兒血清中的表達(dá)量顯著高于CC患兒血清中的表達(dá)量(P<0.000 1)，提示miR-122-5p可能是嬰兒BA潛在治療靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-122-5p在CC及BA患兒血清中的表達(dá)量Fig.1 Expressions of miR-122-5p in serum of children with CC and BA

2.2miR-122-5p對(duì)LX-2細(xì)胞的影響 轉(zhuǎn)染Anti-miR-122-5p或miR-122-5p mimics入LX-2細(xì)胞內(nèi)miR-122-5p的表達(dá)量均有顯著變化(P<0.05)。相較于對(duì)照組LX-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Anti-miR-122-5p顯著抑制LX-2細(xì)胞的增殖活性(P<0.000 1)，并促進(jìn)LX-2細(xì)胞的凋亡(P<0.000 1)，轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics顯著促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖活性并抑制LX-2細(xì)胞的凋亡(P<0.000 1)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Anti-miR-122-5p會(huì)顯著抑制p-AKT蛋白和Ki67蛋白的表達(dá)(P<0.001)；轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics則得到相反的結(jié)果。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-122-5p對(duì)LX-2細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of miR-122-5p on LX-2 cells

2.3miR-122-5p通過(guò)3′-UTR直接靶向PPP2R2A 如圖3A所示，PPP2R2A在其3′-UTR端與miR-122-5p有部分靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-122-5P降低了野生型PPP2R2A的熒光素酶活性(P<0.01，圖3B)，但對(duì)突變型PPP2R2A的熒光素酶活性影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-122-5p顯著下調(diào)LX-2細(xì)胞中PPP2R2A蛋白的表達(dá)(P<0.01，見(jiàn)圖3C、D)。

圖3 PPP2R2A是miR-122-5p的靶基因Fig.3 PPP2R2A is target gene of miR-122-5p

2.4miR-122-5p靶向PPP2R2A影響LX-2細(xì)胞生物學(xué)行為 如圖4所示，通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-122-5p與PPP2R2A mRNA的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染Anti-miR-122-5p或pc-PPP2R2A均顯著上調(diào)PPP2R2A蛋白在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.01)，同時(shí)抑制LX-2細(xì)胞的增殖(P<0.001)并促進(jìn)LX-2細(xì)胞的凋亡(P<0.000 1)。共轉(zhuǎn)染miR-122-5p mimics和pc-PPP2R2A對(duì)PPP2R2A蛋白的表達(dá)量、LX-2細(xì)胞的增殖和凋亡無(wú)顯著影響。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Anti-miR-122-5p或pc-PPP2R2A均會(huì)顯著抑制p-AKT和Ki67蛋白在LX-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(P<0.01)，并上調(diào)AKT蛋白在LX-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(P<0.01)，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-122-5p和PPP2R2A對(duì)上述蛋白的表達(dá)影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 miR-122-5p/PPP2R2A對(duì)LX-2細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of miR-122-5p/PPP2R2A on LX-2 cells

3 討論

眾所周知，肝纖維化是BA的顯著特征，然而肝纖維化的形成機(jī)制仍然是未知的[10]。研究顯示，LX-2細(xì)胞不僅保留了細(xì)胞因子的表達(dá)且還具有有效轉(zhuǎn)染等能力，因此非常適用于人類(lèi)肝纖維化的體外研究[11]。本研究采用LX-2細(xì)胞作為體外研究模型，探究miR-122-5p在BA中的作用機(jī)制。

研究顯示，miRNA有助于BA的診斷[12,13]。在本研究中通過(guò)對(duì)在我院就診的BA及CC患兒血清miR-122-5p的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p在BA患兒血清中的表達(dá)顯著上調(diào)，且抑制miR-122-5p在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)，從而顯著降低LX-2細(xì)胞的增殖活性并抑制Ki67蛋白的表達(dá)，這說(shuō)明miR-122-5p在LX-2細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。PI3-K/AKT信號(hào)通路是參與細(xì)胞功能的重要途徑之一，如細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等，且在肝纖維化的過(guò)程中也常被激活[14-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-122-5p在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)可顯著降低AKT蛋白的磷酸化水平，表明miR-122-5p可能參與了AKT蛋白的活化，影響肝纖維化的進(jìn)程。生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PPP2R2A是miR-122-5p的下游作用靶點(diǎn)，且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了這一預(yù)測(cè)。

PPP2R2A是PPP2A磷酸酶的調(diào)控亞基之一，參與了多種細(xì)胞功能，其中就包括細(xì)胞增殖[20-22]。PPP2A是公認(rèn)的AKT活性調(diào)控因子[23]。有研究報(bào)道稱(chēng)PPP2R2A的異位表達(dá)能有效削弱AKT的Ser-473和Thr-308殘基的磷酸化[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p靶向并抑制了PPP2R2A蛋白的翻譯，且過(guò)表達(dá)PPP2R2A在LX-2細(xì)胞中能有效抑制AKT蛋白的磷酸化，這表明PPP2R2A可能是miR-122-5p與AKT產(chǎn)生作用的中間信號(hào)蛋白。

總之，本研究結(jié)果顯示miR-122-5p在BA患兒血清中的表達(dá)顯著增加，下調(diào)miR-122-5p的表達(dá)對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用并促進(jìn)LX-2細(xì)胞的凋亡，下調(diào)miR-122-5p對(duì)AKT蛋白的活性也有顯著的抑制作用。綜上，本研究證明miR-122-5p在LX-2細(xì)胞內(nèi)通過(guò)調(diào)控PPP2R2A的表達(dá)影響LX-2細(xì)胞的生物學(xué)行為，可能成為BA肝纖維化治療的一種新策略。