金 鑫 陳紅霞

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

光激化學(xué)發(fā)光是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，在免疫檢測(cè)中應(yīng)用前景廣闊。具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)[1]。因其方法的核心特點(diǎn)為均相免沖洗(分離)模式，所以在實(shí)際運(yùn)用中采用夾心法或者競(jìng)爭(zhēng)法等可一步完成反應(yīng)。目前還未在光激化學(xué)發(fā)光平臺(tái)上有間接法檢測(cè)的應(yīng)用。

甲狀腺過(guò)氧化物酶(thyroid peroxidese，TPO)是一種糖基化血紅素蛋白，是甲狀腺細(xì)胞上的跨膜蛋白，其膜外區(qū)的部分酶具有催化活性[2]。甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(Anti-TPO)的檢測(cè)始于20世紀(jì)80年代，1985年Czarnocka等首先證實(shí)純化的微粒體抗原就是TPO，隨后建立了競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性Anti-TPO免疫分析法(非競(jìng)爭(zhēng)法多為間接法)[3]。目前Anti-TPO的檢測(cè)已經(jīng)成為臨床自身診斷免疫性甲狀腺疾病，尤其是橋本氏甲狀腺病的重要參考指標(biāo)[4]。檢測(cè)Anti-TPO的主流方法有酶聯(lián)免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析等[5]。

本研究通過(guò)制備免疫復(fù)合物IgG的多抗，將發(fā)光微粒偶聯(lián)TPO，生物素標(biāo)記抗免疫復(fù)合物IgG抗體，建立了一步間接法用于檢測(cè)人血清Anti-TPO濃度的光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)分析方法，并進(jìn)行了該方法的性能評(píng)估。該Anti-TPO檢測(cè)法在Lica平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了間接檢測(cè)，也對(duì)現(xiàn)有的Anti-TPO檢測(cè)起到了方法學(xué)上的補(bǔ)充作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 人IgG和BCATM Protein Assay Kit購(gòu)自賽默飛公司；乙肝核心抗原購(gòu)自深圳菲鵬公司；重組TPO購(gòu)自DIARECT AG；Anti-TPO國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；96孔反應(yīng)微孔板購(gòu)自浙江拱東醫(yī)療科技有限公司；發(fā)光微粒和Lica通用液(鏈霉親和素包被的感光微粒)由博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司提供；伯樂(lè)質(zhì)控品購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Biotin-NHS購(gòu)自Sigma公司。

1.1.2主要儀器 CR21G高速冷凍離心機(jī)，自日立公司；Lica 500自動(dòng)光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀由嘉興凱實(shí)公司提供；粒徑儀Nicomp 370、酶標(biāo)儀(型號(hào)MK3)購(gòu)自賽默飛公司。

1.2方法

1.2.1人IgG免疫耐受建立 根據(jù)文獻(xiàn)[6]將100 mg的人IgG溶解于5 ml的生理鹽水后與經(jīng)過(guò)抗凝處理的5×109個(gè)兔紅細(xì)胞混合，1 000 r/min離心5 min分離兔紅細(xì)胞，從而去除能與兔紅細(xì)胞特異性識(shí)別并結(jié)合的IgG。將上清液超速離心(15 000 r/min)90 min，取上層1/3的液體，得到處理后的人IgG溶液(去除IgG多聚物，IgG多聚物注射進(jìn)體內(nèi)傾向于產(chǎn)生免疫反應(yīng)而非耐受)。將處理后的人IgG溶液透析至生理鹽水，并稀釋至10 mg/ml，經(jīng)兔耳緣靜脈注射1 ml人IgG，通常在1周后兔子可以產(chǎn)生免疫耐受，該耐受持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到45 d以上，因此選擇在免疫2周后使該兔子處于免疫耐受條件下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫復(fù)合物IgG制備及免疫 用5 ml注射器預(yù)先吸取2 ml用于保存紅細(xì)胞的阿氏液(取20.5 g葡萄糖、8 g檸檬酸鈉、0.55 g檸檬酸、4.2 g氯化鈉，溶于1 L純水。將配制好的溶液高壓滅菌15 min，冷卻后放置于4℃環(huán)境內(nèi)，保存?zhèn)溆?，從兔耳緣靜脈抽取兔全血2～3 ml并輕輕混勻[7]；將抗凝的兔全血轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，加滿生理鹽水混勻后1 000 r/min離心5 min；棄上清，重新加入生理鹽水并混勻，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)上述清洗步驟3遍，得兔紅細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。取2×109個(gè)兔紅細(xì)胞，加入5 ml正常人血清(預(yù)先經(jīng)凝集反應(yīng)篩選)，混勻后室溫反應(yīng)15 min，混勻；1 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀加生理鹽水，混勻，1 000 r/min離心5 min，清洗3遍，加生理鹽水至終體積2 ml，免疫復(fù)合物IgG制備完成。

在上述經(jīng)過(guò)免疫耐受的兔子背部多點(diǎn)注射兔紅細(xì)胞免疫復(fù)合物IgG，1周后重復(fù)以上操作，再次免疫，共免疫4次[8]。

1.2.3抗免疫復(fù)合物IgG抗體的分離和純化 心臟取血，對(duì)血清中的抗免疫復(fù)合物IgG抗體進(jìn)行純化，其原理利用抗免疫復(fù)合物IgG抗體可以識(shí)別免疫復(fù)合物的特點(diǎn)，通過(guò)偶聯(lián)免疫復(fù)合物填料的親和柱將抗免疫復(fù)合物IgG抗體進(jìn)行分離純化。具體過(guò)程是首先制備乙肝核心抗原偶聯(lián)填料的親和柱，用乙肝核心抗體陽(yáng)性血清通過(guò)該親和柱，乙肝核心抗體和乙肝核心抗原會(huì)形成免疫反應(yīng)，使親和柱表面形成乙肝核心抗原-乙肝核心抗體的免疫復(fù)合物，再將需進(jìn)行純化的兔血清過(guò)此親和柱，使兔血清中抗免疫復(fù)合物IgG抗體識(shí)別乙肝核心抗原-乙肝核心抗體的免疫復(fù)合物并結(jié)合至該親和柱，用PBS(pH7.4)洗滌，并用0.1 mol/L甘氨酸(pH3.0)緩沖液將形成免疫反應(yīng)的抗體洗脫。洗脫液用PBS(pH7.4)透析，透析后的洗脫液中會(huì)包含乙肝核心抗體(人抗體)及抗免疫復(fù)合物IgG抗體(兔抗體)。再將以上透析后的洗脫液經(jīng)過(guò)人體IgG免疫親和柱(吸附其中的乙肝核心抗體)，收集穿透液即為抗免疫復(fù)合物IgG抗體，用BCATM Protein Assay Kit檢測(cè)該抗免疫復(fù)合物IgG抗體的蛋白濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4發(fā)光微粒偶聯(lián)TPO 取10 mg粒徑為200 nm的發(fā)光微粒(微粒表面有活性醛基，濃度為20.5 mg/ml)，離心去上清，超聲分散至0.1 mol/L、pH8.6的碳酸氫鈉緩沖液中，按照發(fā)光微粒和蛋白10∶0.1加入TPO(0.1 mg)，加入氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)還原，37℃反應(yīng)過(guò)夜，離心去上清，清洗未結(jié)合在發(fā)光微粒表面的TPO，離心清洗完成后用PBS將偶聯(lián)上TPO的發(fā)光微粒定容至10 mg/ml，作為發(fā)光珠包被濃溶液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5生物素標(biāo)記抗免疫復(fù)合物IgG抗體 取1 mg 的抗免疫復(fù)合物IgG抗體，抗體和生物素以1∶30(摩爾比)比例加入生物素(Biotin-NHS)，4℃混合反應(yīng)過(guò)夜，用透析的方法去除未結(jié)合在蛋白上的生物素，將生物素標(biāo)記好的抗免疫復(fù)合物IgG抗體定容至1 mg/ml，作為生物素標(biāo)記濃溶液，4℃保存，備用。

1.2.6研制試劑的反應(yīng)原理 研制試劑包括發(fā)光微粒偶聯(lián)TPO的發(fā)光微粒試劑，生物素標(biāo)記抗免疫復(fù)合物IgG抗體的生物素標(biāo)記試劑輔以鏈霉親和素(SA)包被感光微粒的Lica通用液進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)樣品中存在Anti-TPO時(shí)，加入發(fā)光微粒試劑和生物素標(biāo)記試劑后會(huì)形成發(fā)光微粒-TPO-Anti-TPO-生物素標(biāo)記抗免疫復(fù)合物IgG抗體的復(fù)合體，再加入Lica通用液后，會(huì)形成發(fā)光微粒-TPO-Anti-TPO-生物素標(biāo)記抗免疫復(fù)合物IgG抗體-SA-感光微粒的復(fù)合體。從而使得發(fā)光微粒和感光微粒緊密聯(lián)系，在680 nm激發(fā)光下，完成化學(xué)發(fā)光過(guò)程。

1.2.7定標(biāo)品的制備 用含1%BSA的PBS將Anti-TPO國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，配制成0、10、30、120、400、1 400 U/ml的定標(biāo)品，分裝成0.5 ml/管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8檢測(cè)方法 將發(fā)光珠包濃溶液用0.02 mol/L HEPES緩沖液(pH8.0,1%BSA)稀釋到40 μg/ml，作為發(fā)光微粒試劑；將生物素標(biāo)記濃溶液用0.05 mol/L Tris緩沖液(pH值8.0,0.1%BGG)稀釋到1 μg/ml，作為生物素標(biāo)記試劑。

在96孔反映微孔板中，每孔依次加入定標(biāo)品或待測(cè)樣品10 μl、發(fā)光微粒試劑50 μl、生物素標(biāo)記試劑50 μl，然后將微孔板置于LiCA HT光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀內(nèi)，第一步溫育設(shè)定為37℃溫育900 s，LiCA通用液加液量設(shè)置為175 μl，其后在37℃溫育600 s后，進(jìn)行信號(hào)采集及讀數(shù)。

1.2.9檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

1.2.9.1最低檢測(cè)限 最低檢測(cè)限是指區(qū)別于零點(diǎn)的最低分析物濃度。重復(fù)檢測(cè)20孔定標(biāo)品1(0 U/ml)，計(jì)算其RLU均值(AVE)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以AVE+2SD反代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的濃度值即為本檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限。

1.2.9.2回收率 取已知濃度1 000～1 200 U/ml的患者血清樣品，對(duì)其連續(xù)5次對(duì)倍稀釋，測(cè)定每次稀釋后的樣品濃度，并與其理論濃度進(jìn)行比較，計(jì)算每次稀釋的回收率。回收率=(實(shí)測(cè)值/理論值)×100%

1.2.9.3重復(fù)性(精密度) 檢測(cè)伯樂(lè)質(zhì)控低、中、高3個(gè)水平(伯樂(lè)質(zhì)控品批號(hào)：Level 1 lot:60201,Level 2 lot:60202,Level 3 lot:60203)的重復(fù)性，將伯樂(lè)質(zhì)控低、中、高3個(gè)水平各平行做20孔，計(jì)算變異系數(shù)(CV)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 取117份臨床患者血清樣本，分別用本研究建立的Anti-TPO檢測(cè)試劑(光激化學(xué)發(fā)光法)和貝克曼試劑(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行檢測(cè)，將兩種方法的測(cè)值結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1最低檢測(cè)限 最低檢測(cè)限具體計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1、2，通過(guò)總標(biāo)線計(jì)算，最終檢測(cè)限為0.09 U/ml。

表1 定標(biāo)曲線Tab.1 Calibration curve

2.2回收率 取已知測(cè)值為1 098.25 U/ml的患者血清，將其連續(xù)5次對(duì)倍稀釋，測(cè)定每次稀釋后的樣品值，測(cè)定結(jié)果如表3,回收率分別為98.86%、98.55%、96.58%、95.10%和92.19%，結(jié)果均分布在90%～110%之間，平均回收率為96.26%。

表2 定標(biāo)品1檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Result of calibration 1

表3 已知Anti-TPO濃度的血清檢測(cè)回收率Tab.3 Recovery ratio analysis of serum

2.3重復(fù)性(精密度) 對(duì)伯樂(lè)質(zhì)控品3個(gè)濃度水平樣品各檢測(cè)20孔，進(jìn)行相關(guān)的精密度計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，可知level 1～3的重復(fù)性分別為1.58%、1.97%、1.73%，重復(fù)性均小于5%，表現(xiàn)良好。

表4 精密度分析Tab.4 Precision analysis

2.4方法學(xué)相關(guān)性分析 相關(guān)性曲線見(jiàn)圖1，直線方程為y=1.027x+2.463，相關(guān)系數(shù)r為0.989，大于0.975，斜率為0.9～1.1，符合要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種檢測(cè)方法具有較好的相關(guān)性。

圖1 本研究新建方法與貝克曼化學(xué)發(fā)光法相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between newly-established method in this study with Beckman test

3 討論

光激化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是一種均相免疫反應(yīng)[9]。在兩種微粒表面包被抗原或抗體，通過(guò)免疫反應(yīng)將兩種微粒拉近，從而使得單線態(tài)氧從感光珠表面?zhèn)鬟f至發(fā)光珠表面，致使發(fā)光珠發(fā)光。因此，該方法的最大特點(diǎn)就是均相反應(yīng)無(wú)需清洗和分離，但造成了間接法很難在該平臺(tái)上使用。

傳統(tǒng)的間接法檢測(cè)Anti-TPO，是將TPO抗原進(jìn)行包被，與樣本先進(jìn)行反應(yīng)。如果樣本中有Anti-TPO，其會(huì)與包被抗原進(jìn)行反應(yīng)，然后通過(guò)洗滌將與包被抗原反應(yīng)的抗體和未反應(yīng)的其他抗體進(jìn)行分離。再加入標(biāo)記的抗人IgG的二抗，實(shí)現(xiàn)對(duì)人血清中的Anti-TPO的活性濃度的檢測(cè)。

本研究通過(guò)使用抗免疫復(fù)合物抗體作為標(biāo)記抗體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)TPO及其抗體形成的免疫復(fù)合物的特異性識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)了一步法免清洗的免疫間接法檢測(cè)，并將其成功應(yīng)用于Lica平臺(tái)。

通過(guò)最終性能的檢測(cè)評(píng)估，本方法設(shè)計(jì)的光激化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體的方法(間接法原理)與傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性較好，最低檢測(cè)限、回收率和精密度等指標(biāo)也符合臨床需求。

隨著免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，均相免洗的免疫檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)會(huì)越來(lái)越明顯，由于均相免洗帶來(lái)的操作便捷，檢測(cè)重復(fù)性好，靈敏度高等優(yōu)勢(shì)正是現(xiàn)在免疫技術(shù)的關(guān)注焦點(diǎn)[10]。而均相技術(shù)在檢測(cè)抗體時(shí)難以使用間接法檢測(cè)的問(wèn)題也會(huì)限制研發(fā)人員對(duì)這些技術(shù)的應(yīng)用。通過(guò)使用抗免疫復(fù)合物抗體，本研究成功地在Lica平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了間接法檢測(cè)Anti-TPO。同樣本研究也可以采取該技術(shù)手段在Lica平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)類似與Anti-TPO等其他抗體的間接法檢測(cè)。甚至可以將其推廣到其他的均相免洗的免疫檢測(cè)方法中去。