廖永強(qiáng) 孟 芳 肖 妮 夏洪嬌 劉劍榮 彭可君 俞丹菁 戴森華

(江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，萍鄉(xiāng) 337000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是以產(chǎn)生多種身抗體為特征的自身免疫性疾病，其主要臨床特征為免疫功能紊亂[1]。細(xì)胞抗原分子表達(dá)失調(diào)、信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤及細(xì)胞因子共同作用促使SLE患者細(xì)胞和體液免疫功能紊亂[2]。體外研究表明，程序性死亡蛋白1(program-med death 1,PD-1)與程序性死亡蛋白配體1(program-med death ligand-1,PD-L1)相互作用抑制SLE患者及健康志愿者T淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，而IFN-α可反向調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)[3，4]。另有研究顯示，IFN-α可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)產(chǎn)生，促進(jìn)B細(xì)胞活化產(chǎn)生致病性自身抗體[5]。體外研究提示IFN-α反向調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)，但在SLE患者體內(nèi)PD-L1和IFN-α與免疫功能的關(guān)系尚不明確。本文擬檢測(cè)抗dsDNA抗體陽性和陰性SLE患者淋巴細(xì)胞表面和血清IFN-α、PD-1/PD-L1表達(dá)水平，分析PD-L1和IFN-α與免疫功能及疾病活動(dòng)相關(guān)性，旨在探討PD-L1及IFN-α與免疫功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 選取2018年1月～2019年12月于我院就診的SLE患者52例，其中男性1例，女性51例，平均年齡(47.4±20.6)歲，記作SLE組，所有患者均符合美國(guó)類風(fēng)濕病學(xué)會(huì)2009年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，活動(dòng)性判定以SLEDAI-2000為標(biāo)準(zhǔn)[6，7]。間接免疫熒光法檢測(cè)抗dsDNA抗體，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將SLE患者分為抗dsDNA陽性組(18例)和陰性組(34例)，平均年齡分別為(38.6±14.3)歲和(42.9±16.1)歲。另選取同期于我院體檢的健康志愿者48例作為健康對(duì)照組(HC組)，其中男性7例，女性41例，平均年齡(36.8±12.4)歲，無自身免疫性疾病，心肌酶譜、肝、腎功能正常。收集所有研究對(duì)象的靜脈血血清于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑與儀器 抗dsDNA試劑盒購自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司(中國(guó))；PD-L1與IFN-α血清檢測(cè)試劑盒購自R&D Systems China；小鼠抗人 IgG1-FITC、IgG1-PE、CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD19-FITC、紅細(xì)胞裂解液、補(bǔ)體C3、C4檢測(cè)試劑盒、FC500流式細(xì)胞儀和IMMAGE800特定蛋白儀均購自貝克曼庫爾特公司(中國(guó))；小鼠抗人PD-L1-PE、PD-1-PE單克隆抗體購自Abcam中國(guó)公司CRP檢測(cè)試劑盒購自利德曼生化股份有限公司。

1.2方法

1.2.1SLE患者和健康對(duì)照組CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞及CD19+B細(xì)胞表面PD-1、PD-L1分子檢測(cè) 所有研究對(duì)象早晨空腹外周靜脈EDTA-K2抗凝采血2.5 ml；每個(gè)流式管加入50 μl全血，分別加入相應(yīng)量的目的抗體震蕩混勻，常溫下避光反應(yīng)20 min；加入200 μl紅細(xì)胞裂解液后常溫裂解紅細(xì)胞直至液體變清；加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 800 r/min離心5 min；棄上清，加0.5 ml PBS，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.2SLE患者和健康對(duì)照組血清PD-L1、IFN-α及疾病活動(dòng)度指標(biāo)檢測(cè) 抗dsDNA抗體滴度檢測(cè)采用ELISA法、定性檢測(cè)采用間接免疫熒光法；PD-L1與IFN-α血清水平檢測(cè)采用ELISA法；補(bǔ)體C3、C4檢測(cè)采用速率散射比濁法；利用全自動(dòng)生化分析儀免疫比濁法檢測(cè)CRP。所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1一般資料及臨床特征 SLE患者及健康志愿者的一般資料及抗核抗體檢檢測(cè)情況與臨床特征見表1。

表1 SLE患者和健康志愿者一般資料Tab.1 General information of SLE patients and healthy volunteers

2.2SLE組和HC組CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表面PD-1和PD-L1分子表達(dá) PD-1在抗dsDNA抗體陽性和陰性SLE患者外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表達(dá)水平均顯著高于HC組(P<0.01),且陽性組均顯著高于陰性組(P<0.01)，結(jié)果見表2。PD-L1在CD3+CD4+T細(xì)胞上表達(dá)水平顯著高于HC組(P<0.01)，且陽性組顯著高于陰性組(P<0.01)，而在CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表面PD-L1分子表達(dá)顯著低于陰性組和HC組(P<0.01)，結(jié)果見表3。

表2 SLE組和HC組淋巴細(xì)胞亞群表面PD-1陽性表達(dá)率Tab.2 Positive rate of PD-1 expression in lymphoid subsets of SLE and HC

表3 SLE組和HC組淋巴細(xì)胞亞群表面PD-L1陽性表達(dá)率Tab.3 Positive rate of PD-L1 expression in lymphoid subsets of SLE and HC

2.3SLE患者和HC組血清PD-L1、IFN-α及疾病活動(dòng)度指標(biāo)的比較 抗dsDNA抗體陽性組血清PD-L1表達(dá)水平顯著低于陰性組和HC組(P<0.01)，而IFN-α顯著高于陰性組和HC組(P<0.01)，兩者在陰性組和HC組間無顯著性差異(P>0.05)。陽性組SLE患者SLEDAI、血清抗dsDNA抗體滴度和CRP均顯著高于陰性組和HC組(P<0.01)，補(bǔ)體C3、C4水平顯著低于陰性組和HC組(P<0.01，表4)。

表4 SLE組和HC組血清PD-L1、IFN-α水平和疾病活動(dòng)性相關(guān)指標(biāo)的比較Tab.4 Comparison of serum levels of PD-L1，IFN-α and disease activity indexes between SLE and HC

2.4SLE患者血清PD-L1與IFN-α和疾病活動(dòng)度指標(biāo)的相關(guān)性 SLE患者血清PD-L1、IFN-α及其與疾病活動(dòng)度指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，PD-L1與IFN-α、SLEDAI、抗dsDNA抗體滴度和CRP呈負(fù)相關(guān)，與補(bǔ)體C3和C4呈正相關(guān)(P<0.05，圖1)。

圖1 SLE患者PD-L1與疾病活動(dòng)性指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation between PD-L1 and disease activity indexs in patients with SLE

3 討論

SLE是一種自身免疫性疾病，細(xì)胞和體液免疫異常導(dǎo)致多種自身抗體產(chǎn)生，對(duì)多器官造成損傷。SLE患者免疫功能紊亂可能是體外環(huán)境誘導(dǎo)、遺傳因素和體內(nèi)細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，但其具體機(jī)制尚不明確[8]。PD-1/PD-L1共刺激分子在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，PD-1與PD-L1結(jié)合后可以傳遞負(fù)性信號(hào)，降低T細(xì)胞活化程度及炎癥反應(yīng)程度[9]。PD-1與PD-L1結(jié)合還與免疫耐受相關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-1或PD-L1基因敲除小鼠易發(fā)展出自身免疫性疾病[10]。有研究表明，SLE患者外周血PD-1+CD3+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞顯著升高，PD-L1+CD19+B 細(xì)胞和 PD-L2+CD14+單核細(xì)胞顯著升高[11]。 付文哲等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在SLE患者外周血T、B細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，而PD-L1在SLE患者外周血B細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在SLE患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表面表達(dá)均上調(diào)，且陽性組高于陰性組，和以上文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示活動(dòng)期SLE患者淋巴細(xì)胞處于活化狀態(tài)。PD-L1在SLE患者外周血CD4+T表面表達(dá)顯著升高，且陽性組高于陰性組，提示當(dāng)CD4+T細(xì)胞過度活化時(shí)，機(jī)體通過其他信號(hào)通路產(chǎn)生細(xì)胞因子促進(jìn)PD-L1表達(dá)從而平衡體內(nèi)細(xì)胞免疫，其原因可能與PD-1/PD-L1參與免疫耐受有關(guān)，與本文結(jié)果陽性組SLE患者血清IFN-α表達(dá)顯著升高相符。本研究發(fā)現(xiàn)抗dsDNA抗體陽性SLE患者CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表面PD-L1分子顯著低于陰性組和HC組。PD-L1 組成性表達(dá)于T、B淋巴細(xì)胞。SLE患者B細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)減少，理論上導(dǎo)致PD-L1 /PD-1通路傳遞給T細(xì)胞的負(fù)信號(hào)減弱，從而使T細(xì)胞持續(xù)激活，激活的T細(xì)胞可輔助B細(xì)胞激活，其中可能包括自身反應(yīng)性B細(xì)胞，后者過度分泌自身抗體最終加重SLE 病情，與謝長(zhǎng)好等[13]報(bào)道一致。SLE患者CD8+T細(xì)胞表面PD-L1分子表達(dá)下調(diào)，可能與SLE患者發(fā)生病毒感染相關(guān)，PD-L1分子表達(dá)下調(diào)使CD8+T細(xì)胞活化殺傷病毒，與本課題前期研究一致[14]。

當(dāng)SLE患者免疫功能紊亂時(shí)，輔助性T淋巴細(xì)胞等單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，包括Ⅰ型干擾素、腫瘤壞死因子和白介素等，一起參與免疫功能的調(diào)節(jié)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，可溶性PD-L1在肺癌患者血清中表達(dá)升高，且與肺癌分期、轉(zhuǎn)移和臨床結(jié)局密切相關(guān)，提示可溶性PD-L1分子能與腫瘤細(xì)胞膜上的PD-1分子相互作用參與免疫功能調(diào)節(jié)[16]。IFN-α作為Toll樣受體通路和干擾素刺激通路的最終產(chǎn)物，能夠反向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，使活化的T淋巴細(xì)胞生存期延長(zhǎng)，還能促進(jìn)記憶性T淋巴細(xì)胞分化[17]。IFN-α還可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞刺激因子產(chǎn)生，B淋巴細(xì)胞通過細(xì)胞受體與免疫球蛋白的結(jié)合而活化和分化，最終產(chǎn)生致病的自身抗體[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者PD-L1血清水平顯著下降，而IFN-α血清水平顯著升高，且PD-L1血清水平與IFN-α呈顯著負(fù)相關(guān)，提示持續(xù)活化的T淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌IFN-α等細(xì)胞因子到血液，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)，減少分泌到血清的PD-L1，共同參與免疫耐受，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。本文還發(fā)現(xiàn)，PD-L1與SLE患者SLEDAI、抗dsDN抗體滴度和CRP呈負(fù)相關(guān)，與補(bǔ)體C3和C4呈顯著正相關(guān)，提示淋巴細(xì)胞表面表達(dá)和分泌的PD-L1和IFN-α與SLE 的病情活動(dòng)性有關(guān)。

綜上，SLE患者淋巴細(xì)胞表面和血清PD-1/PD-L1分子表達(dá)異常與血清IFN-α和疾病活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)。說明PD-1/PD-L1和IFN-α等細(xì)胞因子形成相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與SLE患者免疫功能調(diào)節(jié)。本文僅為臨床實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及淋巴細(xì)胞表面和可溶性血清細(xì)胞因子的檢測(cè)及相關(guān)性分析，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。