舒琳倩 李琳 王雪娟 侯宗柳 王曉丹 綜述 廖力微 審校

2018年全球最新癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，中國(guó)新增惡性腫瘤病例430 萬(wàn)例，新增死亡病例290 萬(wàn)，中國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率居全球第一［1］。惡性腫瘤治療分為：手術(shù)、放療、化療、免疫治療。其中免疫治療有特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)輕等優(yōu)點(diǎn)。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞治療是一種快速發(fā)展的免疫治療方法［2］。CAR-T 細(xì)胞治療是從癌癥患者中分離出T 細(xì)胞，在體外通過基因技術(shù)構(gòu)建CAR，并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增后回輸給患者，CAR-T 細(xì)胞直接靶向殺死腫瘤細(xì)胞并刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)［3］。目前國(guó)內(nèi)外單靶向CAR-T 細(xì)胞在血液腫瘤中的治療效果較好，但靶抗原的丟失也是使用單靶向CAR-T細(xì)胞治療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一［4-5］。如抗CD19和CD22的CAR-T 細(xì)胞治療后，單靶向CAR 通過靶抗原表面表達(dá)的丟失或減少導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸［6-7］。然而，多靶向CAR因?yàn)槟軌蛲瑫r(shí)靶向多個(gè)腫瘤抗原從而降低腫瘤免疫逃逸的可能，已用于臨床惡性腫瘤研究。多靶向CAR 包括2 個(gè)或2 個(gè)以上的單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）區(qū)域，其排列成串聯(lián)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，每個(gè)區(qū)域針對(duì)一個(gè)不同的抗原，并且每個(gè)抗原有使CAR激活的能力［8］。研究表明，同時(shí)針對(duì)多種抗原構(gòu)建的多靶向CAR-T細(xì)胞治療可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，并有助于克服因單一可變抗原丟失發(fā)生的復(fù)發(fā)［5］。多靶向CAR-T 細(xì)胞治療是最近腫瘤研究的熱點(diǎn)，眾多惡性腫瘤的研究突破均與其相關(guān)，它是惡性腫瘤靶向治療的主要方式，也是攻破癌癥復(fù)發(fā)的關(guān)鍵措施之一。

1 多靶向CAR-T的概念及效應(yīng)機(jī)制

多靶向CAR-T 是賦予T 細(xì)胞多抗原特異性，允許scFv區(qū)域結(jié)合2個(gè)及以上的特異性腫瘤抗原，并均可觸發(fā)完整的CAR 信號(hào)并驅(qū)動(dòng)T 細(xì)胞活化、增殖和發(fā)揮細(xì)胞毒活性。目前通過下述4 種方法可實(shí)現(xiàn)多靶向CAR-T 的效應(yīng)機(jī)制：①產(chǎn)生2 個(gè)或更多表達(dá)不同CAR 的細(xì)胞群并將其一起或順序地注入體內(nèi)；②使用雙順反子表達(dá)載體，在同一細(xì)胞上編碼2個(gè)不同CAR；③同時(shí)設(shè)計(jì)2 種不同結(jié)構(gòu)的T 細(xì)胞（共轉(zhuǎn)導(dǎo)），及上述方法①和方法②的相結(jié)合，將不同方法產(chǎn)生的雙CAR 同時(shí)表達(dá)在細(xì)胞組成的CAR-T 亞群；④使用單個(gè)載體將雙特異性或串聯(lián)的CARs 在同一嵌合蛋白上編碼2個(gè)CARs［9］。

多靶向CAR-T 中，以雙靶向CAR 最常見。雙靶向CAR 可以根據(jù)其識(shí)別并結(jié)合腫瘤特異性抗原的scFv與CAR的內(nèi)域連接方式分為以下3種：雙價(jià)串聯(lián)CAR結(jié)構(gòu)（bivalent“tandem”CAR），雙價(jià)環(huán)狀CAR結(jié)構(gòu)（bivalent“l(fā)oop”CAR）和Dual CAR 結(jié)構(gòu)。雙價(jià)串聯(lián)CAR 是一種功能嵌合抗原受體，是能夠介導(dǎo)T 細(xì)胞的雙特異性激活和靶向性的新型人工分子［10］。雙價(jià)環(huán)狀CAR 結(jié)構(gòu)是在串聯(lián)雙靶CAR-T 的基礎(chǔ)上，將分別攜帶2 個(gè)靶點(diǎn)的scFv 區(qū)在細(xì)胞外形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)［5］。Dual CAR 是由2 種不同抗原為靶點(diǎn)在不同單鏈抗體上同時(shí)表達(dá)形成的兩種CAR，此種結(jié)構(gòu)是通過編碼內(nèi)部的同一啟動(dòng)子的相同雙順反子載體形成的序列，從而使兩個(gè)CAR 在T 細(xì)胞質(zhì)膜上同時(shí)表達(dá)，因此有助于同時(shí)靶向多種腫瘤抗原，增強(qiáng)治療效果［4，11］。

2 多靶向CAR-T的主要靶點(diǎn)

靶向多個(gè)抗原的CAR-T細(xì)胞療法是一種有效克服抗原逃逸的策略，其中比較重要的是靶點(diǎn)的類型［8］。目前多靶向CAR-T在血液系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和胸部等惡性腫瘤中有一定的研究進(jìn)展。

2.1 多靶向CAR-T 在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的主要靶點(diǎn)

血液惡性腫瘤多靶向CAR-T的主要靶點(diǎn)有：CD19、CD20和CD22（三價(jià)CAR-T）［12］；CD20和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）［13］；CD123和CD19［14］；CD19和CD70［15］；CD19和CD79b［16］；CD13 和T 細(xì)胞免疫球蛋白黏液素3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM3）［17］；B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）和鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)親環(huán)素配體耦合體［18］；BCMA 和CD19［19-20］；BCMA 和CD319［21］。其中抗CD19和抗BCMA多靶向CAR-T在多發(fā)性骨髓瘤中療效較好，在臨床前實(shí)驗(yàn)中，首次報(bào)道了新型靶點(diǎn)CD19和BCMA的Tan-CAR-T，此種雙靶向CAR-T的細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞溶解活性能力均與單靶向CAR-T相當(dāng)，但在體內(nèi)研究中，對(duì)小鼠異種移植模型中表達(dá)CD19和BCMA的多發(fā)性骨髓瘤生長(zhǎng)有特異性的抑制作用，并且有助于降低單靶向CAR-T細(xì)胞治療后的復(fù)發(fā)率［20］。在一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，將抗CD19和抗BCMA CAR-T輸入復(fù)發(fā)或者難治性多發(fā)性骨髓瘤的21例患者中，有20例患者對(duì)治療有反應(yīng)，其中有17例患者在隨訪期間（17～602天）無(wú)復(fù)發(fā)和進(jìn)展［19］。因此，雙靶向CAR-T可能是治療復(fù)發(fā)性或難治性多發(fā)性骨髓瘤的一種有前途的治療方式。此外，關(guān)于第4代雙靶向CAR-T的病例報(bào)道發(fā)現(xiàn)，1例患有原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的老年患者，在大劑量化療搶救治療失敗后發(fā)生第2次復(fù)發(fā)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，組織中的CD19、CD70表達(dá)，采用抗CD19和CD70 Dual CAR-T治療，患者在無(wú)細(xì)胞因子釋放綜合征、CAR-T細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性或其他嚴(yán)重并發(fā)癥的情況下生存期超過17個(gè)月，在CAR-T細(xì)胞輸注321天后仍然可以檢測(cè)到抗CD19和CD70 CAR-T細(xì)胞［15］。以上研究表明多靶向CAR-T細(xì)胞靶向2種及2種以上相關(guān)抗原可能是解決難治性疾病或疾病復(fù)發(fā)問題的一種有希望的策略，并且有延長(zhǎng)患者生存期的治療效果。

2.2 多靶向CAR-T 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤中的主要靶點(diǎn)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤治療效果較好的靶點(diǎn)有：HER2和白介素13受體α2（interleukin-13 receptor α2，IL-13Rα2）［22］、表皮生長(zhǎng)因子受體變體Ⅲ（epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ，EGFRvⅢ）和表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）［23］。在臨床前模型中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在單靶向CART細(xì)胞治療后，由于抗原變異逃逸，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，為了減少抗原逃逸現(xiàn)象發(fā)生，提高T細(xì)胞的抗腫瘤活性，設(shè)計(jì)了一個(gè)抗HER2 scFv和抗IL13Rα2 scFv靶點(diǎn)串聯(lián)組成的CAR外域（TanCAR），TanCARs通過誘導(dǎo)HER2-IL13Rα2異二聚體與HER2和IL13Rα2同時(shí)結(jié)合，當(dāng)這2種抗原同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，促進(jìn)了T細(xì)胞活化。這種活化的T細(xì)胞比聯(lián)合表達(dá)抗HER2-CAR和抗IL13Rα2-CAR的T細(xì)胞、聯(lián)合表達(dá)非特異性CAR-T細(xì)胞或聯(lián)合表達(dá)產(chǎn)物的T細(xì)胞更持久且不易耗盡［22］。此外，在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，EGFRvⅢ和EGFR構(gòu)成的雙特異性CAR-T細(xì)胞治療陽(yáng)性的EGFRvⅢ的膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤小鼠模型，所有小鼠均有持久的應(yīng)答反應(yīng)［23］。此外，已有研究證明抗EGFR CAR-T細(xì)胞治療腫瘤的主要不良反應(yīng)是皮膚毒性［24］，但是在人體皮膚移植的小鼠模型中，雙特異性CART細(xì)胞治療后無(wú)證據(jù)表明對(duì)皮膚模型有毒性［23］。

2.3 多靶向CAR-T 在消化系統(tǒng)惡性腫瘤和胸部惡性腫瘤中的主要靶點(diǎn)

消化系統(tǒng)惡性腫瘤治療效果較好的靶點(diǎn)是：人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（trophoblast cell surface antigen 2，Trop2）和細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）［25］、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和間皮素（mesothelin，MSLN）［26］。胸部惡性腫瘤治療效果較好的靶點(diǎn)：纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activating protein，F(xiàn)AP）和單克隆抗體F19［27］。Trop2和PD-L1是胃癌的雙特異性靶點(diǎn)，臨床前研究中，雙靶向CAR-T細(xì)胞治療對(duì)Trop2和PD-L1陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞有特異性的殺傷能力，雙特異性抗Trop2和抗PD-L1 CART細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的干擾素γ和IL-2；在人胃癌異種移植模型中，雙靶向CAR-T細(xì)胞經(jīng)瘤內(nèi)注射可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，其中腫瘤生長(zhǎng)曲線的統(tǒng)計(jì)分析表明，抗Trop2和抗PD-L1 CAR-T組的腫瘤體積明顯小于單靶向CART對(duì)照組；因此抗Trop2和抗PD-L1雙特異性CAR-T細(xì)胞的殺傷能力和抑制作用高于單靶向CAR-T細(xì)胞［25］。CEA和MSLN是胰腺癌的雙特異性靶點(diǎn)，在異種移植瘤實(shí)驗(yàn)中，由CEA和MSLN構(gòu)成的Dual CAR-T細(xì)胞治療雙抗原陽(yáng)性的胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1腫瘤移植小鼠，Dual CAR-T細(xì)胞可顯著抑制AsPC-1腫瘤的生長(zhǎng)，與單靶向CAR-T細(xì)胞相比，具有較高的抗腫瘤活性。Dual CART細(xì)胞可精確定位于腫瘤部位，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度的殺傷作用，同時(shí)減輕了“靶上、靶外”毒性［26］。

FAP和F19是惡性胸膜間皮瘤的雙特異性靶點(diǎn)，F(xiàn)AP主要表達(dá)于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的表面以及特定的腫瘤類型，F(xiàn)19是一種單克隆抗體，可在臨床試驗(yàn)中識(shí)別未降解的FAP［27-28］，但是兩者聯(lián)合的抗FAP-F19-ΔCD28/CD3ζ-CAR在CD8陽(yáng)性的T細(xì)胞中表達(dá)，此種T細(xì)胞可以導(dǎo)致IFNγ特異性的釋放，其中的雙特異性抗原重新定向的T細(xì)胞在體外裂解抗原陽(yáng)性間皮瘤細(xì)胞和炎性成纖維細(xì)胞，增強(qiáng)抗癌活性［27］。

3 多靶向CAR-T的主要優(yōu)勢(shì)

單靶向CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)最常見的機(jī)制是靶抗原丟失。目前，已證明抗原的丟失可以通過抗原逃逸、譜系轉(zhuǎn)換和抗原下調(diào)3種不同的機(jī)制發(fā)生?？乖右輽C(jī)制是由惡性腫瘤通過獲得性突變、選擇性剪接靶點(diǎn)基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保留突變的錯(cuò)誤折疊的靶點(diǎn)蛋白而產(chǎn)生［11，29］。譜系轉(zhuǎn)換是指腫瘤細(xì)胞通過表型轉(zhuǎn)換至不同的譜系，這種轉(zhuǎn)換過的譜系不具備原有的靶向受體，因此細(xì)胞可以通過譜系轉(zhuǎn)換來(lái)完成抗原丟失的過程，最終導(dǎo)致抗原丟失，及腫瘤抵抗情況發(fā)生［30］。多靶向CAR-T可以避免抗原丟失的情況發(fā)生，在異種移植實(shí)驗(yàn)中，取來(lái)源于復(fù)發(fā)患者的標(biāo)本建立異種移植模型，其中復(fù)發(fā)模型HMB28（CD19-/CD22+）是由于原發(fā)性致癌因子的一個(gè)點(diǎn)KRAS G12D發(fā)生突變，導(dǎo)致CD19由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，但雙靶向CAR-T能阻止HMB28的進(jìn)展［5］，這表明多靶向CAR-T可有效的防止由于基因突變導(dǎo)致的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)為陰性的問題。多靶向CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化和提升，可促進(jìn)免疫治療的發(fā)展。因此，研究證明CAR結(jié)構(gòu)中胞外區(qū)構(gòu)象和單鏈抗體定位對(duì)雙靶CAR的活性有顯著的影響［8］。靶向FMS樣酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）在約30%急性髓性白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）患者中發(fā)生突變，患者預(yù)后較差，以單鏈抗體結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn)的最初抗FLT3-CAR結(jié)構(gòu)無(wú)法區(qū)分野生型和突變型FLT3，因此需要另一個(gè)靶點(diǎn)。靶向FLT3的配體可能是一種更有效的消除白血病的策略，并同時(shí)降低脫靶反應(yīng)［31］。因此多靶向CAR-T可能是克服單靶向CAR-T細(xì)胞治療后靶點(diǎn)突變或抗原下調(diào)的有效策略之一。

4 多靶向CAR-T聯(lián)合其他療法

多靶向CAR-T 可以聯(lián)合其他治療方式，增強(qiáng)殺瘤效果。如多靶向CAR-T聯(lián)合藥物、抗體、疫苗或者PD-L1 和程序性死亡受體-1（programmed cell death protein-1，PD-1）阻斷劑來(lái)治療癌癥。1）多靶向CAR-T 聯(lián)合藥物治療：雙靶向FLT3 和FLT3 的配體的CAR-T 同時(shí)使用FLT3 抑制劑克林苯胺（crenolanib）聯(lián)合治療可以導(dǎo)致FLT3 表達(dá)上調(diào)及改善CAR-T 細(xì)胞的活性，從而減少FLT3 陰性比例［32］，提示多藥物聯(lián)合治療可以作為預(yù)防抗原丟失的一種潛在策略。2）多靶向CAR-T 聯(lián)合抗體治療：其中最廣為人知的結(jié)構(gòu)是雙特異性T 細(xì)胞接合器（CAR-T cells secreting BiTEs）［33］，BiTE 是一端靶向腫瘤抗原而另一端是靶向CD3ε 區(qū)域的雙特異性可溶性抗體［34］，雙特異性抗體是在一個(gè)分子中有2個(gè)不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體［35］。此種結(jié)構(gòu)的CAR-T細(xì)胞能夠?qū)⒖扇苄钥贵w傳遞到實(shí)體腫瘤微環(huán)境中［23］，將CAR-T與抗體結(jié)合治療。3）多靶向CAR-T 聯(lián)合疫苗治療：最新的研究表明，安非他明疫苗聯(lián)合雙特異性CART，與單用雙特異性CAR-T相比，可增強(qiáng)殺瘤效應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩和生存期延長(zhǎng)［36］，有利于提高抗原特異性表達(dá)，減少表面抗原丟失的現(xiàn)象發(fā)生，增強(qiáng)CAR-T 抗實(shí)體瘤活性，突破實(shí)體瘤治療瓶頸。4）多靶向CAR-T細(xì)胞聯(lián)合PD-L1或PD-1阻斷劑治療：將BCMA 和CD319 的雙 靶向CAR-T 聯(lián)合PD-1 阻斷劑，可進(jìn)一步加速體內(nèi)腫瘤的初始清除率，獲得治療的持久性［21］。因此多靶向CAR-T聯(lián)合其他方式治療惡性腫瘤可能是克服癌癥轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的有效策略之一。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，多靶向CAR-T 在治療惡性腫瘤方面具有廣泛的適用性，能夠減少腫瘤復(fù)發(fā)的問題。并且，三價(jià)CAR-T細(xì)胞也正在研發(fā)中，可用于治療血液惡性腫瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［37］。雖然多靶向CAR-T療法相對(duì)于單靶向CAR-T具有明顯的潛在優(yōu)勢(shì)，但這些產(chǎn)品在安全性、有效性和可行性方面還有一些尚未解決的問題，如細(xì)胞介導(dǎo)毒性、PD-L1 與腫瘤細(xì)胞結(jié)合、T細(xì)胞分化和衰竭導(dǎo)致治療效果下降等問題［38-40］。隨著研究的深入，未來(lái)可優(yōu)化多靶向CAR-T 的設(shè)計(jì)，擴(kuò)大多靶向CAR-T 的研究，多靶向CAR-T聯(lián)合其他方式治療惡性腫瘤可能是未來(lái)的發(fā)展方向。多靶向CAR-T可能成為克服抗原逃逸最為有效的方式之一，從而降低癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。