劉 嬌，郝小利,2，李秀麗，劉 東，石 磊，陳凱彪，劉開拓，王曉泉,2,3，顧 敏,2,3*，劉秀梵,2,3

(1.揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點開放實驗室，江蘇揚州225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室，江蘇揚州225009)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，包裝有8 個負(fù)義、單鏈、分節(jié)段的RNA 片段，根據(jù)基因序列長度可分為 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS[1]基因。目前，AIV 共包括16 種HA 亞型，其中H5 和H9 是兩種在全球家禽群體中廣泛流行的主要亞型。流行病學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2.3.4.4 分支H5NX 亞型病毒中的H5N6 已經(jīng)取代H5N1 成為國內(nèi)流行的主要高致病性AIV 亞型[2]；同樣，H9N2 亞型低致病性AIV 在我國持續(xù)進(jìn)化的過程中演變出了眾多基因型[3]，由最初流行的BJ/94-like (A 型)逐漸被F/98-like (H型)取代，且自2007 年之后，雞群中以F/98-like 作為結(jié)構(gòu)骨架整合入G1-like 的PB2 和M 基因而形成的S 型H9N2 病毒株又不斷增多并逐漸建立起穩(wěn)定種系[4]，成為當(dāng)前的主流基因型，并頻繁地為H7N9、H10N8 等致人感染的新型重組流感病毒提供全套內(nèi)部基因[5]。在我國，已經(jīng)獲得地方流行性的H5 和H9 亞型AIV，極有可能通過基因互換產(chǎn)生自然重配型病毒。并且，目前禽體內(nèi)、環(huán)境樣品以及人感染病例中均已經(jīng)出現(xiàn)了內(nèi)部基因完全來源于H9N2 的新型重組 H5N6 病毒[6-8]。

本研究室前期相關(guān)研究表明，含有G1-like PB2和 M 基因的 H9N2 AIV，其內(nèi)部基因與 H5 亞型AIV 的表面基因具有高度的兼容性[9]。蒲娟等對國內(nèi)H9N2 亞型病毒進(jìn)化動態(tài)的研究也指出，當(dāng)前占據(jù)優(yōu)勢流行的基因型相較于其它基因型，在雞體內(nèi)具有更強(qiáng)的感染性和更長的排毒時間；且G1-like M基因的引入可以顯著提高H9N2 AIV在雞體內(nèi)的適應(yīng)性[10-11]。但是，在全套內(nèi)部基因均與H9N2 亞型AIV 高度同源的重組 H5N6 AIV 中，G1-like PB2 和M 基因是否仍具有明顯競爭優(yōu)勢以及兩者是否具有協(xié)同效應(yīng)尚不清楚。因此，本研究基于A 型流感病毒傳統(tǒng)的8 質(zhì)粒反向遺傳學(xué)技術(shù)平臺，同時以含有G1-like 和F/98-like 這兩種不同進(jìn)化譜系 PB2 和 M基因的10 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染體系，嘗試評價不同基因型H9N2 AIV供體在H5N6 亞型AIV 重配中的作用，部分解釋H9N2 AIV為H7N9、H10N8 等新型重組流感病毒提供整套內(nèi)部基因的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞系 3 株H5N6 AIV均來自本實驗室前期的分離株，其6 個內(nèi)部基因均與當(dāng)前流行的優(yōu)勢S 基因型H9N2 AIV 高度同源，病毒株名稱分別為 A/chicken/Anhui/MZ34/2016/(H5N6)、A/chicken/Henan/YB0597/2016/(H5N6)、A/chicken/Zhe jiang/JT131/2016/(H5N6)，以下分別簡稱為 MZ34、YB0597、JT131[12]。pHW2000 載體由美國 St.Jude 兒童醫(yī)院Webster 博士惠贈，目的基因源于H 基因型H9N2病毒株A/chicken/Shanghai/14/2001 的質(zhì)粒pHW2000-PB2 和 pHW2000-M (即 F98/like 來源的 PB2 和 M 質(zhì)粒)由本實驗室構(gòu)建保存，以下簡稱為SH14-PB2 和SH14-M[13]。293T 和MDCK 細(xì)胞由本實驗室保存，CEF 細(xì)胞由本實驗室制備。H5N6 亞型高致病性AIV 相關(guān)操作在揚州大學(xué)動物生物安全三級實驗室(ABSL-3)中進(jìn)行。

1.2 主要試劑 高保真酶(2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix)、同源重組試劑(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶(BsmB I)購自NEB 公司；轉(zhuǎn)染試劑、病毒RNA 提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自Qiagen 公司；12 堿基反轉(zhuǎn)錄引物(5'-AGC AAAAGCAGG-3')、擴(kuò)增引物根據(jù) H5N6 亞型 AIV PB2、M 基因片段保守序列利用SnapGene 3.1.1 軟件自行設(shè)計(表1)，由南京金斯瑞公司合成。

1.3 同源重組法構(gòu)建重組質(zhì)粒 分別提取MZ34、YB0597、JT131 的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄得到各自的cDNA，利用高保真DNA 聚合酶和表1 的克隆引物擴(kuò)增病毒各基因節(jié)段，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。按同源重組試劑盒說明書，將回收的目的片段與經(jīng)BsmBⅠ酶切后的線性載體pHW2000 連接轉(zhuǎn)化后，分別提取疑似陽性質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序驗證，最后分別構(gòu)建MZ34 株8 個基因的重組質(zhì)粒(MZ34-PB2、MZ34-PB1、MZ34-PA、MZ34-HA、MZ34-NP、MZ34-NA、MZ34-M、MZ34-NS)、 YB0597 株 的 PB2 和 M 質(zhì) 粒 (YB0597-PB2、YB0597-M)以及 JT131 株的 M 質(zhì)粒(JT131-M)，共計構(gòu)建11 個重組質(zhì)粒，各重組質(zhì)粒均經(jīng)酶切和測序鑒定。

表1 同源重組法構(gòu)建重組質(zhì)粒的引物Table 1 Primers for construction of recombinant plasmids via homologous recombination

1.4 10 質(zhì)粒競爭性病毒拯救 傳統(tǒng)的8 質(zhì)粒拯救系統(tǒng)是通過反向遺傳學(xué)操作技術(shù)，將A 型流感病毒的8 個基因節(jié)段分別克隆至雙向轉(zhuǎn)錄/ 表達(dá)載體pHW2000 中后進(jìn)行病毒拯救。本研究在此基礎(chǔ)上又增加了含不同進(jìn)化譜系PB2 和M 基因的重組質(zhì)粒，即采用同時包含G1-like 和F/98-like 的雙重PB2 和M 質(zhì)粒，以大于A 型流感病毒基因組8 個基因節(jié)段的數(shù)量進(jìn)行10 質(zhì)粒競爭包裝來拯救重組病毒。參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒的使用說明，將10 質(zhì)粒(每質(zhì)粒400 ng)共轉(zhuǎn)染293T/MDCK 細(xì)胞進(jìn)行重組病毒的拯救，5 % CO237 ℃培養(yǎng)72 h，反復(fù)凍融后收集上清，用于后續(xù)空斑純化實驗。為排除同一母本病毒(MZ34) 8 質(zhì)粒易于自我組合包裝的可能干擾，并確定G1-like PB2 與M 基因之間是否具有協(xié)同作用，本研究共進(jìn)行了3 種10 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的組合，依次為Group1：MZ34(8)+F/98(PB2+M)、Group2：MZ34(6)+YB0597(PB2+M)+F/98(PB2+M)和 Group3：MZ34(6)+YB0597(PB2)+ JT131(M)+F/98(PB2+M)，如圖 1 所示。此外，對上述轉(zhuǎn)染組中所有可能出現(xiàn)的重組H5N6 AIV， 包 括 rMZ34、 rMZ34-SH14PB2、 rMZ34-SH14M、rMZ34-SH14PB2+M、rMZ34-YB0597PB2+M、rMZ34-YB0597PB2-SH14M、rMZ34-SH14PB2-YB0597M、rMZ34-YB0597PB2-JT131M和 rMZ34-SH14PB2-JT131M，分別進(jìn)行質(zhì)粒拯救，并按Hoffmann 等[14]設(shè)計的PB2 和M 引物進(jìn)行測序鑒定，序列正確后再進(jìn)行后續(xù)空斑形成能力的分析。

1.5 重組H5N6 AIV 的空斑形成能力測定 測定1.4 中拯救的 9 株重組 H5N6 AIV 在CEF 細(xì)胞中的TCID50值，分別以 MOI0.1、0.01、0.001、0.0001 劑量的病毒接種24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的CEF (每個稀釋度均重復(fù)3 孔)，1 h～1.5 h 后覆蓋瓊脂，待36 h～48 h 后，顯微鏡下確認(rèn)CEF 發(fā)生病變后，中性紅染色，根據(jù)染色后病毒空斑的個數(shù)及大小判斷各病毒的空斑形成能力。

1.6 拯救病毒的空斑純化 將10 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后收獲的細(xì)胞上清10 倍倍比稀釋至10-3，以原液、10-1、10-2、10-3共 4 個稀釋度的病毒液分別以 100 μL/ 孔感染12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的CEF(每個稀釋度均重復(fù)6 孔)，按1.5 中步驟進(jìn)行后續(xù)試驗，染色后在形成空斑的最高稀釋度的孔內(nèi)挑出一定數(shù)量(n＞50)的單個空斑，分別進(jìn)行下一輪空斑試驗，試驗流程如圖2，連續(xù)3 輪空斑純化后，提取第三輪病毒空斑的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR 鑒定[14]PB2 和M基因并測序，計算并分析空斑中PB2 和M 基因的構(gòu)成情況。

圖2 病毒空斑純化流程Fig.2 Illustrationof virus-plaque purification

2 結(jié) 果

2.1 重組H5N6 AIV 的拯救 酶切鑒定及測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒MZ34-PB2、MZ34-PB1、MZ34-PA、MZ34-HA、MZ34-NP、MZ34-NA、MZ34-M、MZ34-NS、YB0597-PB2、YB0597-M、JT131-M 均正確構(gòu)建。利用8 質(zhì)粒拯救系統(tǒng)拯救如1.4 所述3 組共9株重組H5N6 AIV，測序結(jié)果顯示重組病毒無交叉污染且片段無突變，表明拯救了各重組病毒。

2.2 重組H5N6 AIV 的空斑形成能力測定 9 株重組H5N6 病毒在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上均能形成空斑。通過統(tǒng)計各稀釋度的病毒空斑數(shù)(為3 個獨立重復(fù)孔內(nèi)空斑數(shù)的平均值)，結(jié)果顯示在MOI 為0.001 和0.0001 時，孔內(nèi)分別形成17～21 和3～6 個肉眼可見、直徑在1 mm 左右的單個空斑，空斑數(shù)量和大小之間無明顯差異(表2)，表明9 株重組病毒的空斑形成能力基本一致。因此，在后續(xù)空斑純化過程中，各10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組內(nèi)由不同PB2 與M 基因組合形成的4 種重組H5N6 AIV，其形成的單個空斑被挑到概率基本相同。。

表2 不同劑量的各重組H5N6 AIV 在CEF 中形成的空斑數(shù)Table 2 Plague numbers of H5N6 reassortants in different dilutions

2.3 拯救重組H5N6 AIV 中PB2 與M 基因不同組合模式的分析 各10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組拯救的各重組病毒第一輪空斑純化的結(jié)果顯示，病毒原液與10-1稀釋度形成的空斑相對密集且部分融合，無法精確計算；病毒10-2稀釋度可形成8～12 個單個空斑；而10-3稀釋度則無空斑形成。因此挑取10-2稀釋度的6個重復(fù)孔內(nèi)的全部單個空斑進(jìn)行后續(xù)空斑純化，共計挑取空斑數(shù)(即拯救的重組H5N6 AIV 數(shù)量)為Group1 (64 個)、Group2 (63 個)、Group (56 個)。由拯救的重組H5N6 AIV PB2 和M 基因測序結(jié)果顯示，各10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均可形成4 種重組病毒，與預(yù)期相符(表 3)。Group 1：MZ34(8)+F/98(PB2+M)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組拯救病毒的數(shù)據(jù)顯示，4 種重組H5N6 AIV數(shù)量由多至少依次為：PB2(S)+M(S)＞PB2(S)+M(H)＞PB2(H)+M(S)＞PB2(H)+M(H) (圖3)，且 G1-like PB2和M 相較于F/98-like 相應(yīng)基因在數(shù)量上都占有絕對優(yōu)勢(圖4A、圖4B)。進(jìn)一步為排除MZ34 本身8 個質(zhì)粒易于自我包裝的可能干擾，Group 2：MZ34(6)+YB0597 (PB2+M)+F/98 (PB2+M) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組將MZ34-PB2、MZ34-M 替換為仍屬 G1-like 譜系但來源于不同YB0597 株的PB2 和M，拯救病毒數(shù)據(jù)顯示PB2(S)+M(S)重組病毒數(shù)量仍最多，但PB2(H)+M(S)重組病毒數(shù)量最少(圖3)。然而，PB2 和M 基因的構(gòu)成情況表明，G1-like PB2 基因在數(shù)量上仍占絕對優(yōu)勢，G1-like M 基因卻無優(yōu)勢(圖4A、圖4B)。最后為確定G1-like PB2 基因在前兩組中表現(xiàn)出的競爭優(yōu)勢不受同一病毒株來源G1-like M 基因的影響，即驗證G1-like PB2 和M 基因之間是否存在疊加效應(yīng)，在MZ34(6)+YB0597(PB2)+JT131(M)+F/98(PB2+M)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，將YB0597-M 替換成仍為G1-like譜系但不同來源的JT131-M 株，結(jié)果顯示PB2(S)+M(S)重組病毒數(shù)量下降至第二位，不再具有明顯優(yōu)勢(圖3)，但PB2 和M 基因的構(gòu)成情況與Group 2：MZ34(6)+YB0597(PB2+M)+F/98(PB2+M)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組結(jié)果一致(圖4A、圖4B)。表明，相較于F/98-like PB2 與 M 基因，G1-like PB2 基因在 H5N6 亞型AIV 重配中具有更顯著的競爭優(yōu)勢，G1-like M 基因僅在MZ34(8)+F/98(PB2+M)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出優(yōu)勢，且G1-like PB2 與M 基因間的優(yōu)勢疊加效應(yīng)不明顯。

表3 拯救的重組H5N6 病毒的類型和數(shù)量Table 3 Type and number of the rescued H5N6 reassortants

圖3 拯救的重組H5N6 AIV 中PB2 和M 基因不同組合模式的比例Fig.3 Percentage of different combinations between PB2 and M genes of the rescued H5N6 reassortants

圖4 拯救的重組H5N6 AIV 中不同進(jìn)化譜系PB2 基因(A)和M 基因(B)的構(gòu)成比例Fig.4 Percentage of different lineages of PB2 gene (panel A) and M gene (panel B) among the rescued H5N6 reassortants

3 討 論

H9N2亞型AIV 自1998 年在我國大部分地區(qū)流行以來，一直持續(xù)存在于國內(nèi)雞群中且演變產(chǎn)生了A-W 等眾多基因型，其中A、H、S 基因型在不同時期內(nèi)分別占據(jù)優(yōu)勢地位，而S 基因型自2007 年以來逐漸取代此前流行的H 型成為當(dāng)前我國的優(yōu)勢基因型[15]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，S 基因型H9N2 AIV不僅已被確認(rèn)可與H5N1、H6N1、H6N2 和H6N6 亞型AIV 發(fā)生廣泛重配[16-19]，而且可作為內(nèi)部基因供體給 H5N2、H7N7、H5N6、H7N9 和 H10N8 等致人或禽感染的新型重組病毒提供全套內(nèi)部基因[4]，對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅。結(jié)合當(dāng)前我國H5亞型AIV 的遺傳進(jìn)化和生態(tài)學(xué)特征，優(yōu)勢流行的H5N6 AIV 極易與H9N2 AIV 在自然界發(fā)生重配，且在家禽體內(nèi)已檢測到含有H9N2 AIV 全套內(nèi)部基因的重組H5N6 AIV。由于相較此前流行的H 基因型，S 基因型H9N2 AIV 最顯著的變化在于 F/98-like 的M 和 PB2 基因分別相繼被替換為 G1-like 的 M 和PB2 基因，因此，不同H9N2 AIV 供體在H5N6 亞型AIV 重配中是否具有差異以及何種進(jìn)化譜系可能更具有競爭優(yōu)勢，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究基于一株內(nèi)部基因與S 基因型H9N2 AIV 高度同源的H5N6 流行株，構(gòu)建包含G1-like PB2 和M 基因的8 質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，并額外添加含有F/98-like 的PB2 和M 質(zhì)粒，以雙份病毒的PB2 和M共10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行重組H5N6 病毒的競爭性拯救，并對拯救病毒經(jīng)3 輪空斑純化后提取其RNA經(jīng)測序來評價不同進(jìn)化譜系PB2 和M 基因的競爭優(yōu)勢。結(jié)果表明，G1-like PB2 基因相較于F/98-like PB2 基因，在3 種不同10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的H5N6 亞型AIV 重配中均具有更顯著的競爭優(yōu)勢；而G1-like M基因相較于F/98-like M 基因，僅在MZ34(8)+F/98(PB2+M)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出優(yōu)勢，且同一進(jìn)化譜系重組病毒PB2 與M 基因的競爭優(yōu)勢疊加效應(yīng)不明顯。

在H9N2 AIV 的進(jìn)化史上，G1-like 和F/98-like AIV譜系之間不斷發(fā)生基因重配：在2007 年G1-like M 基因首次被引入F/98-like (H 型)病毒中形成過渡性的O 基因型；同年在O 基因型的基礎(chǔ)上再次引入G1-like PB2 基因從而形成S 基因型H9N2 AIV 并逐漸替代前期流行的H 基因型在雞群中建立起穩(wěn)定的種系[19]。因此，G1-like PB2 基因相對于G1-like M基因在S 基因型H9N2 亞型AIV 重配中發(fā)揮更加主導(dǎo)的作用。對應(yīng)地，本研究中G1-like PB2 基因在各10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中均具有更顯著的競爭優(yōu)勢；而G1-like M 基因在 MZ34(6)+YB0597(PB2+M)+F/98(PB2+M)和MZ34(6)+YB0597(PB2)+JT131(M)+F/98(PB2+M)這2 組母本H5N6 AIV 基因組雜合的轉(zhuǎn)染組均未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，這樣的結(jié)果也提示相較于G1-like M 基因，G1-like PB2 基因在此類含H9N2 全套內(nèi)部基因的H5N6 亞型AIV 重配中具有更為突出的作用。

為了探究G1-like PB2 和M 基因之間是否存在競爭優(yōu)勢的疊加效應(yīng)，本研究設(shè)計了3 種不同的10質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組合策略：母本H5N6 AIV 基因組來源一致的MZ34(8)+F/98(PB2+M)組、母本H5N6 病毒的PB2 和M 基因被同時替換為相同基因型H5N6 AIV 另一流行株的 MZ34(6)+YB0597(PB2+M)+F/98(PB2+M)組以及母本 H5N6 AIV 的 PB2 和 M 基因被分別替換為相同基因型H5N6 AIV 不同流行株的MZ34(6)+YB0597(PB2)+JT131(M)+F/98(PB2+M)組。結(jié)果顯示，G1-like PB2 和 M 基因僅在 MZ34(8)+F/98(PB2+M)組呈現(xiàn)明顯的疊加效應(yīng)；而在MZ34(6)+YB0597(PB2+M)+F/98(PB2+M)組，拯救的重組H5N6 AIV 中PB2 和M 基因不同組合模式的占比由高到低雖為 PB2(S)+M(S)＞PB2(S)+M(H)＞PB2(H)+M(H)＞PB2(H)+M(S)，但 G1-like PB2 和 M 基因間的優(yōu)勢疊加效應(yīng)卻大幅降低；最后，在MZ34(6)+YB0597(PB2)+JT131(M)+F/98(PB2+M)組，PB2(S)+M(S)組合的重組H5N6 AIV 在數(shù)量上已不具有優(yōu)勢，G1-like PB2 和M 基因間未表現(xiàn)疊加效應(yīng)。因此認(rèn)為G1-like PB2 和M 基因之間存在一定的競爭優(yōu)勢疊加效應(yīng)，但可能與病毒株的特異性密切相關(guān)。

綜上所述，本研究表明在含H9N2 AIV 整套內(nèi)部基因的H5N6 亞型AIV 重配中，G1-like PB2 基因相較于F/98-like PB2 基因具有更顯著的競爭優(yōu)勢；G1-like PB2 基因相較于G1-like M 基因發(fā)揮更加主導(dǎo)的作用；G1-like PB2 與M 基因間有限的優(yōu)勢疊加效應(yīng)具有病毒株依賴性。上述結(jié)果將為深入探究S基因型H9N2 AIV 在新型重組流感病毒產(chǎn)生中的內(nèi)部基因優(yōu)勢供體及相關(guān)機(jī)制奠定重要的實驗基礎(chǔ)。