陳小翠，楊 陳，李志航，劉華鋒

(廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病研究所，湛江市慢性腎臟病防控重點實驗室，廣東 湛江 524001)

1 TFEB結構簡述

人類小眼畸形轉錄因子(microphthalmia-associated transcription，MIT)家族屬于Myc轉錄因子超家族，具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZip)結構。該家族包含轉錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)、轉錄因子EC、轉錄因子E3(transcription factor E3，TFE3)及小眼畸形相關轉錄因子四個成員，在所有脊椎類動物中保守存在，并且在結構上有相似之處。TFEB作為該家族的成員之一，定位于6號染色體上，全長52 246 bp，其中有8個外顯子，8個轉錄本，編碼蛋白長度為19～159個氨基酸不等。

TFEB作為MIT家族成員中的一個轉錄調節(jié)因子，其與bHLHZip區(qū)域特異性結合并識別回文CACGTG E-盒序列，同時能夠識別其他bHLHZip轉錄因子不具有的不對稱TCATGTG M-盒序列，表達出表觀分子量分別約為60 ku和53 ku的蛋白。其側接上游堿性區(qū)域，可與同源或異源寡聚化和高親和性的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)基團進行結合。在無DNA基團的情況下，四聚體大小的TFEB解離為DNA二聚體形式。

2 TFEB的功能簡述

2.1 生理學作用目前已明確的TFEB下游基因有400多個，被證實調控自噬-溶酶體通路相關基因有73個。包括溶酶體水解酶和輔助蛋白基因23個；溶酶體膜蛋白相關基因9個；溶酶體V-ATP酶泵基因14個；溶酶體生物發(fā)生調節(jié)子相關基因10個和自噬調節(jié)基因17個。當細胞遭受饑餓、溶酶體應激、線粒體損傷等因素刺激時，定位于溶酶體膜上的TFEB發(fā)生去磷酸化入核，與介導溶酶體新生基因結合，促進溶酶體新生，維持細胞穩(wěn)態(tài)。同時其在調控天然免疫和適應性免疫以及其他細胞代謝及分化過程中均發(fā)揮至關重要的作用。

2.2 TFEB異常調控參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展TFEB正常表達可維持細胞穩(wěn)態(tài)及調節(jié)免疫。而其表達或調節(jié)異常與人類多種疾病密切相關。

有學者發(fā)現，控制TFEB轉錄的染色體發(fā)生易位時，TFEB高度活化，介導了腎癌[1]的發(fā)生；而TFEB在內皮細胞中的過度表達卻可有效地抑制炎癥[2]。另有研究表明，TFEB表達降低時，可導致機體發(fā)生糖脂代謝紊亂、胱氨酸尿癥、溶酶體儲積癥以及各種神經退行性疾病的進展。此外TFEB的結構或功能失調在硫酸酯酶缺乏癥、龐貝氏癥和抗胰蛋白酶缺乏癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也得到了證實。

由于TFEB在多種疾病的發(fā)生發(fā)展進程中的關鍵作用，了解其作用機制，以及如何通過調控其機制進而延緩疾病的進展，具有重要的意義。

3 TFEB具體調控機制

3.1 轉錄層面調控啟動子是核糖核酸 (ribonucleic acid，RNA) 聚合酶特異性識別和結合DNA的序列，是基因的一個組成部分，控制著基因的轉錄起始時間及表達程度。人的TFEB啟動子序列是其上游的1 986 bp片段。有學者研究發(fā)現染色體易位導致第6號染色體上的TFEB開放閱讀框與第11號染色體上的非蛋白質編碼α基因的5'調節(jié)區(qū)融合，TFEB啟動子被替換，導致TFEB轉錄水平明顯上調以及使TFEB蛋白質表達量增高達60倍，高表達的TFEB導致腎腫瘤的發(fā)生[1]。

另外，Alghamdi等[3]研究發(fā)現活化JAK可促進下游的轉錄因子信號傳導及轉錄激活因子1與TFEB啟動子結合，促使TFEB的轉錄活性升高，沉默Janus激酶2可降低TFEB啟動子活性，降低TFEB轉錄，蛋白質表達及去磷酸化入核，導致TFEB所介導自噬功能發(fā)生受損。而胱氨酸腎病基因表達沉默的人肝癌細胞、胱氨酸蛋白酶所致的胱氨酸尿癥、人類免疫缺陷病毒感染后的患者均出現了TFEB轉錄水平的下降，導致了疾病的發(fā)生及加速了疾病的進展。

另有研究表明，不同濃度的H2O2刺激293T細胞，表現為TFEB mRNA水平及TFEB蛋白水平升高，同時促進TFEB的核易位進而應對活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的損傷刺激[4]，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理的巨噬細胞、單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)處理影響心肌細胞以及抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)和SS-31的作用，均觀察到作用于TFEB的轉錄水平所起到的保護性作用。

除啟動子的調控外，近期也有少量的研究發(fā)現非編碼單鏈RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)參與調節(jié)TFEB的轉錄。如Malouf等[5]研究發(fā)現在TFEB高表達所致的腎癌的過程中與肺腺癌轉移相關轉錄子1 的IncRNA融合相關，而Settembre等[6]學者研究表明TFEB作為一個功能蛋白，是miR-128的靶標，具有微調自噬的轉錄的作用。而Song等[7]的研究發(fā)現m6A甲基轉移酶和ALKB同源蛋白5可通過與TFEB的3'-UTR末端結合，使TFEB末端的兩個m6A殘基發(fā)生甲基化修飾，反向調控TFEB的轉錄活性，從而在缺血性心臟病中起保護作用。

3.2 蛋白修飾層面調控目前關于TFEB調節(jié)的研究，關注最多的是蛋白修飾層面的調控，尤其是各種因素介導的TFEB去磷酸化入核的調控，下面就各種調節(jié)形式介導的磷酸化調節(jié)進行簡單闡述。

3.2.1依賴于mTOR的磷酸化調節(jié) 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細胞內一類絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是介導溶酶體再生的一個激活位點。mTOR作為一個營養(yǎng)傳感器，與TFEB的功能息息相關。根據細胞的營養(yǎng)狀態(tài)，TFEB遵循兩種不同的循環(huán)：在氨基酸豐富時，它在溶酶體和胞質溶膠之間連續(xù)穿梭，而在饑餓時它從胞質溶膠轉運到細胞核。近年來，有研究顯示mTORC1介導TFEB的S211氨基酸基團磷酸化。當應用mTOR抑制劑Torin1抑制其活性時S211A彌散存在于胞質中，TFEB發(fā)生核易位。該研究還表明S122D的突變可以阻斷S211A的作用，進而使TFEB發(fā)生核易位[8]。另有研究發(fā)現，mTORC1介導的TFEB的S211磷酸基團的活性依賴于YWHA(14-3-3)蛋白的狀態(tài)。14-3-3是使TFEB在胞質溶膠中保持隔離的胞質分子伴侶蛋白，是將TFEB定位于細胞質中的一個阻遏物。在營養(yǎng)豐富狀態(tài)下，Rag GTP酶具有活性，可募集合成代謝激酶復合物mTOR，使TFEB的絲氨酸S211殘基發(fā)生磷酸化產生14-3-3的結合位點，促進TFEB與14-3-3蛋白結合，形成復合物，使TFEB的Rag結合結構域被14-3-3蛋白掩蓋，TFEB失活，從而保留在胞質中。在營養(yǎng)缺乏所致的氨基酸減少或缺失的情況下，Rag GTP酶和mTORC1被滅活。TFEB/14-3-3復合物發(fā)生解離，解離后的TFEB迅速發(fā)生去磷酸化入核，啟動下游基因，調節(jié)相應生物學過程，以維持細胞的穩(wěn)態(tài)。有趣的是，有學者在mTORC1抑制的過程發(fā)現，除了S211發(fā)生去磷酸化外，S142也發(fā)生去磷酸化，但其去磷酸化之后所發(fā)揮的作用是否跟TFEB的核轉運有關至今尚未明確。

3.2.2依賴PKC的磷酸化調節(jié) 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一個非依賴于mTOR而調節(jié)TFEB活化的因子。有研究顯示蛋白激酶C的β亞基(PKC β)與TFEB的核易位密切相關。TFEB包含一個絲氨酸豐富的C末端區(qū)域，PKC β參與該末端區(qū)域磷酸化。在小鼠的破骨細胞中，使用PKC活化劑誘導磷酸化絲氨酸殘基(S462A/S463A/S466A/S467A/S469A)而激活PKC β，可觀察到TFEB核轉運現象，而PKC α和PKC δ的激活不會通過磷酸化C末端引發(fā)TFEB核易位。另一項研究表明，TFEB可突變相應PKC β保守的C末端的絲氨酸殘基(S462，S463，S466，S467和S469)而不是N端氨基酸(氨基酸88-219)[9]使天冬氨酸磷酸化。由此導致的絲氨酸及天冬氨酸的突變，核易位增加。該現象表明，PKC β末端殘基的磷酸化可能伴隨著TFEB的核易位。且該現象的出現并不伴隨著細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)所介導的TFEB的絲氨酸末端殘基S142A的磷酸化以及mTORC1活性的變化。這說明了PKC β所介導的TFEB核轉位現象并不依賴于ERK及mTORC1而發(fā)揮作用。但有趣的是，雖然PKC α和PKC δ亞基不可直接影響磷酸化TFEB的活性，但其可通過抑制糖原合成酶激酶3β亞型(glycogen synthase kinase 3 β，GSK3β)上游誘導TFEB激活。GSK3β主要通過磷酸化S134和S138位點與mTORC1相互作用，增加S211A的磷酸化，加速TFEB與14-3-3蛋白的結合，抑制TFEB的核轉運。由于PKC位于很多信號通路的下游, 包括G蛋白偶聯(lián)受體介導的GαQ/11信號、甘油二酯、Toll樣受體的先天免疫和受體酪氨酸激酶過程。因此，佛波醇酯、血管緊張素II以及LPS均依賴于PKC所介導的TFEB活化。

3.2.3鈣調磷酸酶的脫磷酸化調節(jié) 鈣調磷酸酶(calcineurin，CaN)是迄今發(fā)現的唯一受Ca2+或鈣調蛋白調節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白質。參與多種信號轉導通路，且可調節(jié)TFEB的核轉運。當細胞處于饑餓時，S211發(fā)生去磷酸化，TFEB迅速轉運入核。而這個去磷酸化過程目前被認為有兩種調節(jié)方式：1)通過減少mTORC1的活性減少S211的磷酸化；2)通過直接調控S211釋放粘質蛋白1(mucolipin 1，MCOLN1)以及激活鈣調神經磷酸酶的活性。減少mTORC1的活性進而減少S211的磷酸化，使TFEB-14-3-3復合物發(fā)生解離啟動TFEB的入核，前面已經闡述。如何直接調控S211釋放MCOLN1以及激活鈣調神經磷酸酶的活性，調節(jié)TFEB核轉位是問題的關鍵。

研究表明，在人類IV型脂質沉積癥以及人的成纖維細胞饑餓后，TFEB的核易位是減少的。而人類成纖維細胞在饑餓時，核轉運并沒有減少。這種看似相反現象的出現與什么因素相關？最近的一項研究發(fā)現，過表達TFEB促進溶酶體定位于質膜表面，同時增加溶酶體Ca2+的緩沖能力[10]。溶酶體緩沖能力也隨著饑餓程度的增加而增加，形成一個正反饋回路，進一步說明溶酶體鈣的重要性。另有研究發(fā)現，鞘氨醇作為酸性儲存鈣釋放的一個正向調節(jié)器，可調節(jié)TFEB核易位從而調節(jié)自噬[11]。因此，溶酶體的鈣和鈣調神經磷酸酶在S211、S142這兩個氨基酸殘基在參與TFEB去磷酸化的亞細胞定位過程中發(fā)揮重要作用，盡管如何通過該通路發(fā)揮作用，至今尚未明確。而使用氧化劑氯胺T或已知內源性產物ROS(如魚藤酮、過氧化氫、氰氯苯腙)進行處理，伴隨著溶酶體MCOLN1鈣釋放和CaN的激活，TFEB被誘導激活[12]。且該研究還表明CaN與TFEB物理特性相關。以上研究充分證明CaN的激活足以控制TFEB核易位。饑餓導致增加溶酶體鈣釋放和CaN的活化可以直接使TFEB發(fā)生去磷酸化。

除了上述所提及的依賴或非依賴于mTOR的磷酸化修飾TFEB作用外，ERK信號、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路、蛋白激酶B信號通路或GSK3均可在TFEB的不同Ser磷酸化位點與TFEB結合介導其磷酸化及去磷酸狀態(tài)。甚至有研究表明，在總的TFEB表達明顯增高的情況下，磷酸化的TFEB可被調節(jié)入核，但是確實存在該現象，仍需進一步證實?？傊{節(jié)TFEB的核易位，在維持細胞穩(wěn)態(tài)的過程中至關重要。

3.2.4TFEB蛋白分子的乙?；{節(jié) 乙酰化是將乙?；D移到氨基酸側鏈基團的過程。TFEB的乙?；揎検欠駮FEB的活性造成影響，是研究者關注的另一問題。Bao等[13]學者的研究表明，在阿爾茨海默病患者的在小膠質細胞中，K116R突變體可使TFEB在賴氨酸116位點發(fā)生乙?；?含有乙酰賴氨酸的肽FAAHISPAQGSPKPPPAASPGVR與TFEB進行免疫共沉淀實驗，發(fā)現在K116位點發(fā)現有區(qū)域的匹配，在該位點在進化中高度保守)促使TFEB發(fā)生核易位，入核后的乙?；疶FEB與SIRT1蛋白結合，發(fā)生翻譯后修飾，SIRT1介導的TFEB去乙?；ㄟ^增強溶酶體生物合成促進含纖維樣β-淀粉樣蛋白的小膠質細胞降解和使淀粉樣蛋白斑塊減少。

TFEB在乙?；牒撕笮枰诤藘冗M行適當的修飾才能發(fā)揮作用，且與前面去磷酸化入核的作用不同，是否去磷酸化入核也需要相應的翻譯后修飾，而其他尚未知道的如泛素化修飾、甲基化修飾等過程是否也涉及這種調節(jié)機制，至今仍然是個謎。

3.3 核內抑制因子對TFEB的調節(jié)TFEB除受上述因素的調節(jié)外，其活性受核內抑制因子的調控。ZKSCAN(ZNF306)屬于含有KRAB和SCAN結構域的鋅指轉錄因子家族。該轉錄阻遏蛋白家族在細胞中發(fā)揮的作用包括細胞增殖、凋亡、核仁維持和腫瘤轉化，且該家族DNA結合蛋白ZKSCAN3能夠抑制已知參與自噬和溶酶體功能的60多種TFEB靶基因的轉錄，并在沉默時可增加TFEB所介導的自噬及溶酶體新生。且研究表明至少一部分自噬和溶酶體基因(sgsh，hexa，ctsa，atp6v1e1，stomatin，granulin，map1lc3b)被ZKSCAN3和TFEB反向調控。TFEB過表達的HeLa細胞(以下簡稱TFEB細胞)敲低ZKSCAN3，TFEB介導的下游相關基因的表達水平超過單獨TFEB過表達所達到的水平。該現象提示了兩個轉錄因子在調節(jié)自噬及溶酶體功能過程中偶聯(lián)。此外，饑餓或Torin1刺激可發(fā)現ZKSCAN3在細胞質堆積，而TFEB發(fā)生核易位，該現象進一步說明了ZKSCAN3和TFEB可能通過完全相反的機制協(xié)調應對饑餓和其他外界因素的刺激，且有學者研究發(fā)現激活PKC可使GSK3β失活， TFEB發(fā)生磷酸化，核易位及活化水平降低，而PKC激活同時可導致c-Jun氨基末端激酶磷酸化使ZKSCAN3去磷酸化入核[14]，并發(fā)現依賴于mTOR的形式可將TFEB與ZKSCAN3兩個并行信號偶聯(lián)。而Chauhan等[15]也在細胞饑餓時觀察到相同的現象。除了阻遏蛋白ZKSCAN3外，新近學者的相關研究表明TFEB還受到負調控轉錄因子MXL3(Max-like 3)及FOXK等的共同調節(jié)，進而維持機體的穩(wěn)態(tài)。

3.4 TFEB的降解蛋白質的合成過程受多種因素的影響，包括轉錄、翻譯及翻譯后修飾等，TFEB作為一個關鍵的靶蛋白分子也不例外。

近來學者研究發(fā)現使用自噬誘導劑氯喹刺激細胞15小時，TFEB蛋白表達減少[16]。而在戈謝病患者體內發(fā)現，突變細胞的TFEB受蛋白酶體系統(tǒng)的降解增加，最終導致疾病的進展，且這種突變細胞是受突變體GCase的影響同時調控了TFEB轉錄及翻譯的穩(wěn)定。而針對戈謝病患者的成纖維細胞的研究：用溴環(huán)已胺醇，有助于逆轉突變體GCase對TFEB的影響，阻斷蛋白酶體降解TFEB的能力，使TFEB mRNA的上調和蛋白表達升高。Takamitsu等[17]學者的研究表明接觸金屬銀24 h后，TFEB的蛋白質及mRNA表達下降，但是并不影響其核易位水平。在MAO刺激、抗氧化劑NAC及胱氨酸尿癥患者的細胞均觀察到相同的現象。綜上，TFEB蛋白分子的降解增多，對疾病的進展也起著不可或缺的作用。

4 調節(jié)TFEB的藥物

在了解上述調節(jié)機制的基礎上，研究者逐漸尋找靶向調節(jié)TFEB的藥物，并取得一些進展。

4.1 促進TFEB轉錄及表達近來有研究表明部分藥物可能通過干預TFEB啟動子，影響其轉錄，如Zhang等[18]發(fā)現，姜黃素可增加人結腸癌HCT116細胞和小鼠胚胎成纖維細胞的死亡，其主要通過結合TFEB的啟動子增加其轉錄活性并促進核易位[18]。Awad等[19]研究發(fā)現，在戈謝病中，重組GCase可增加TFEB的穩(wěn)定性并上調TFEB靶基因表達，促進溶酶體新生，改善致病基因?(葡萄糖腦苷脂酶基因)對TFEB介導溶酶體新生功能的抑制作用[19]。而使用不同濃度紅景天苷作用24h后，TFEB mRNA表達顯著增加同時可促進TFEB去磷酸化入核，增加TFEB活性。Arunava等[20]學者的研究發(fā)現使用過氧化物酶體增殖物激活型受體α的激動劑吉非貝齊與全反式視黃酸可通過與TFEB的啟動子PPRE-和RXR-結合位點結合，增強腦細胞中的TFEB表達,調節(jié)自噬-溶酶體通路，進而在溶酶體儲積癥中起治療作用；此外，Moskot等學者發(fā)現染料木黃酮可提高TFEB基因表達水平及抑制mTOR使TFEB去磷酸化入核，改善溶酶體儲積癥。而3,4-二甲氧基查耳酮也被證實可提高TFEB的表達水平，改善自噬流，起到保護心臟的作用。

4.2 促進TFEB去磷酸化及入核除介導TFEB的轉錄和蛋白表達上升的藥物外，調節(jié)TFEB去磷酸化入核的藥物也有所發(fā)現。如前述藥物姜黃素及紅景天苷在啟動TFEB轉錄時，也可促進其蛋白去磷酸化增加其活性，發(fā)揮相應的治療作用。另外，mTOR特異性抑制劑Torin1、PP242、雷帕霉素及抗炎物質柚皮素等也可使TFEB發(fā)生去磷酸化入核，進而改善相應的疾病；而Song等[21]的研究發(fā)現，化合物Compound C1可直接結合TFEB的N端介導其核轉運，成為神經退行性疾病的潛在治療藥物[21]；Zhitomirsky等[22]發(fā)現，抗腫瘤藥物多柔比星和米托蒽醌可使TFEB發(fā)生核轉位促進溶酶體新生，針對TFEB的靶點進行隔離是克服抗腫瘤藥物耐藥性的新策略；Zhang等[23]發(fā)現海藻糖可通過阻斷肝細胞代謝而激活經典型的適應性禁食信號，激活肝臟及肝外組織的過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子(peroxisome proliferative activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)-成纖維細胞生長因子21信號通路進而激活TFEB的去磷酸化入核。而在Batten疾病模型小鼠的研究中發(fā)現，海藻糖和MK2206通過抑制AKT而非ERK的活性加速TFEB的去磷酸化入核，促進神經退行性疾病如帕金森病患者神經元的α-synuclein的清除，保護多巴胺神經元[24-25]；此外，還有學者發(fā)現，海藻糖可通過調節(jié)叉頭轉錄因子O3的磷酸化激活，增加共激活因子相關的精氨酸甲基轉移酶1的活性，增加TFEB的核轉位誘導運動神經元變性模型的自噬，以及通過促發(fā)溶酶體膜透化釋放Ca2+激活PPP3介導TFEB去磷酸化入核起到保護神經元的作用；不僅如此，Wu等人的研究發(fā)現，海藻糖還可以通過抑制AKT激活AMPK使TFEB活化及發(fā)生核轉運，發(fā)揮調節(jié)自噬的作用，抑制氧化應激及凋亡，提高移植皮瓣的生存率[26]。使用雌激素相關受體α及雌激素相關受體γ的抑制劑或敲低其基因，可增加PGC-1α mRNA的表達進而使GSK3β活性降低，TFEB的核移位增多；而受體相互作用蛋白激酶1抑制劑也可增加TFEB的核定位，從而促進自噬。

針對TFEB調節(jié)機制的靶向調節(jié)藥物中，目前研究僅局限于轉錄層面及蛋白層面，且在蛋白層面的調節(jié)主要集中在TFEB的去磷酸化入核，增加其活性的基礎上進行闡述，針對TFEB蛋白的乙?；壳吧形从懈深A藥物。此外，在針對TFEB的負調控因子ZKSCAN3、MXL-3及叉頭樣轉錄因子等的干預藥物以及抑制TFEB降解的藥物仍有待進一步的研究。

5 總結

TFEB作為調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)及機體發(fā)病過程的一個重要轉錄因子，其調節(jié)機制在機體的各個層面發(fā)揮著重要的作用。隨著分子生物學研究的不斷深入，調節(jié)TFEB的各種機制及針對各種機制的靶向藥物均得到了一定程度的認識。該綜述旨在總結TFEB蛋白分子的調控機制及其靶向調節(jié)藥物為進一步探討及研究受TFEB調節(jié)異常所致的各種疾病提供新的藥物治療方向。