楊秀芳，簡 潔

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 桂林 541100)

冠狀動脈阻塞，心肌供氧不足，耗氧增加導(dǎo)致的心肌壞死是急性心肌梗死的基本病因。急性心肌梗死誘發(fā)因素眾多，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。從來源廣泛的中草藥中分離高效低毒活性成分，用于防治心肌梗死，成為近年來該領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)[2-3]。自噬是一種保守的細(xì)胞自我降解的過程，在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，長期嚴(yán)重的缺血/缺氧誘導(dǎo)的過度自噬會加重心肌損傷甚至引發(fā)心衰[4]。九龍?zhí)偈且环N廣西民族特色中草藥，據(jù)報道，其提取物具有活血化瘀、抗炎、抗氧化和抗血小板聚集等多種藥理作用[5]。課題組前期研究亦表明，九龍?zhí)倏傸S酮(Bauhiniachampioniiflavones，BCF)對垂體后葉素所致心肌缺血具有保護(hù)作用，并可通過激活PI3K/Akt通路調(diào)控自噬減輕心肌缺血/再灌注損傷[6-8]，但BCF對心肌細(xì)胞缺血/缺氧損傷的作用尚未可知。

1 材料

1.1 H9c2大鼠心肌細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 試劑九龍?zhí)倏傸S酮：本室分離，總黃酮含量以蘆丁計為82%，其分離純化方法見文獻(xiàn)[9]?？ㄍ衅绽?Captopril，批號SLBM6819V)、氯喹(Chloroquine，CQ,批號BCBM9716V)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA，貨號M9281)與雷帕霉素(Rapamycin，Rapa，貨號R8140)購自Sigma公司；胎牛血清(貨號13011-8611-100mL)、高糖及無糖DMEM(批號2044490)購自Gibco公司；Giemsa染色液(批號20190606)、DAPI染色液(批號20181030)購自索萊寶生物科技公司；CCK-8試劑盒購于東仁化學(xué)科技上海有限公司(批號KH741)；cTnI試劑盒(批號W090186)與CK-MB試劑盒(批號Jun 2019)分別來自武漢華美生物公司和上海酶連生物科技公司；Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒(批號133F082)來自漢恒生物科技上海有限公司；TransZol UP(批號N10212)、TransScript One-Step Gdna Removal and cDNA Synthesis SuperMix(批號L20731)、GAPDH 抗體(批號M21109)等購自全式金生物科技公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(批號00684721)購自Applied Biosystems Instruments公司，引物購自Thermo Fisher Scientific公司；LC3抗體(批號DQ0262)來自Elabscience；Cathepsin D抗體(批號00058789)來自Proteintech Group；P62抗體(批號GR124843-26)來自Abcam。

1.3 儀器CO2孵箱(日本SANYO，型號MCO-15AC)；厭氧培養(yǎng)箱(上海龍躍，型號LAI-3T)；酶標(biāo)儀(TECAN，型號infinite F50)；正置熒光顯微鏡(德國ZEISS，型號Z2)；超微量核酸定量儀(Thermo Scientific，型號NanoDrop One)；實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，型號CFX96TMReal-Time System)；免疫印跡化成像系統(tǒng)(Bio-Rad，型號ChemiDocTMXRS+)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與OGD模型的建立10%胎牛血清與90%高糖DMEM配制的完全培養(yǎng)基用于H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，并根據(jù)文獻(xiàn)方法建立細(xì)胞OGD模型[10]，將培養(yǎng)液換成不含血清的無糖DMEM培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移細(xì)胞至含94% N2、5% CO2、1% O2的手套培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h模擬心肌缺血/缺氧。

2.2 藥物預(yù)處理與分組H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組。模型組細(xì)胞按照2.1所述方法建立OGD模型，正常組細(xì)胞用高糖DMEM在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時間。除正常和模型組外，藥物干預(yù)組細(xì)胞于造模前4 h加入相應(yīng)藥物。

2.3 Giemsa染色法觀察H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×105個/孔密度種于底部鋪有潔凈細(xì)胞爬片的6孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔。造模結(jié)束后，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，之后以PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入400 μL Giemsa染液染色20 min，棄液后再用PBS洗滌2次，濾紙輕輕吸去多余液體，正置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 CCK-8檢測細(xì)胞活力心肌細(xì)胞以104個/孔密度接種于96孔板，根據(jù)上述方法進(jìn)行藥物預(yù)處理和建立模型。根據(jù)試劑盒說明書于450 nm處檢測OD值。

2.5 Elisa檢測cTnI和CK-MB含量根據(jù)試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cTnI、CK-MB含量。

2.6 腺病毒(Ad-mRFP-GFP-LC3)轉(zhuǎn)染觀察自噬體及自噬溶酶體數(shù)量H9c2心肌細(xì)胞以1×106個/孔的密度種于底部鋪有細(xì)胞爬片的6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔加入含15 μL腺病毒的新鮮培養(yǎng)基感染細(xì)胞6 h。按實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行藥物預(yù)處理并建立OGD模型。待造模結(jié)束，以PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10分鐘，根據(jù)DAPI試劑盒說明書染色，抗熒光淬滅劑封片。正置熒光顯微鏡下觀察熒光斑點(diǎn)數(shù)量。在3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組至少隨機(jī)計算10個細(xì)胞熒光斑點(diǎn)數(shù)并最終取其平均值。

2.7 RT-qPCR檢測基因的表達(dá)用TRIzol裂解細(xì)胞，氯仿和異丙醇等有機(jī)溶劑提取純化總RNA，超微量核酸定量儀分析RNA的質(zhì)量和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix用于定量mRNA的表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定。用相對定量法計算基因相對表達(dá)量,2-ΔΔCt方法用于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers of assessed genes

2.8 Western blot 檢測蛋白表達(dá)以組織、細(xì)胞高效裂解液和蛋白酶抑制劑(100 ∶1)配置而成的混合液提取細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組取20 μg總蛋白用于SDS-PAGE凝膠電泳。以5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，4 ℃一抗孵育PVDF膜過夜后，TBST洗膜3次并用二抗孵育1 h。用Image J分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間比較用t檢驗(yàn)法，以單因素方差分析法進(jìn)行多組間比較。

3 結(jié)果

3.1 BCF對缺氧H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響如Fig 1所示，正常細(xì)胞為長梭形，排列較整齊且緊密；而模型組細(xì)胞生長密度低，部分細(xì)胞變不規(guī)則形狀，細(xì)胞核固縮；與模型組相比，BCF干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞脫落減少，密度增加，狀態(tài)較好，與陽性藥卡托普利效果相當(dāng)。

3.2 BCF對缺氧心肌細(xì)胞活力的影響如Fig 2所示，模型組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01vsControl)；兩種劑量BCF均提高OGD心肌細(xì)胞活力(P<0.05vsOGD)，其中，低劑量組效果最好，與陽性藥卡托普利相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 BCF對缺氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中cTnI和CK-MB含量的影響由Tab 2可知，OGD心肌細(xì)胞上清液中cTnI與CK-MB含量明顯升高(P<0.01vsControl)，而兩種劑量BCF均可減少cTnI和CK-MB含量(P<0.05 orP<0.01vsOGD)，減輕心肌細(xì)胞損傷，且低劑量效果更佳。據(jù)此，我們選擇低劑量BCF進(jìn)一步研究藥物對自噬的作用。

Fig 1 Effect of BCF on H9c2 cardiomyocytes morphology (×200)

Fig 2 Effect of BCF on viability of H9c2 cardiomyocytes suffered OGD n=6)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsOGD group;△P<0.05vsOGD+Captopril group

Tab 2 Effect of BCF on contents of cTnI and CK-MB in H9c2 cardiomyocytes exposed to OGD n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOGD

3.4 BCF對自噬體與自噬溶酶體形成的影響以帶熒光標(biāo)記LC3的腺病毒轉(zhuǎn)染檢測活細(xì)胞中的自噬體與自噬溶酶體[11]。當(dāng)自噬形成時，LC3蛋白定位于自噬體膜上，隨后LC3蛋白隨自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。由于GFP是一種酸敏感物質(zhì)，溶酶體的酸性環(huán)境易淬滅GFP熒光，而mRFP在酸性環(huán)境下可穩(wěn)定存在，因此GFP與mRFP熒光融合而成的黃色熒光代表自噬體，而單獨(dú)的mRFP熒光斑點(diǎn)代表自噬溶酶體。結(jié)果如Fig 3所示，模型組與Rapa組細(xì)胞中黃色與紅色熒光斑點(diǎn)的數(shù)量明顯增加(P<0.01vsControl)，自噬增加；而BCF與3-MA預(yù)處理的細(xì)胞中，黃色和紅色熒光斑點(diǎn)明顯減少，自噬受抑制(P<0.05vsOGD)。

3.5 BCF對缺氧心肌細(xì)胞LC3、P62 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 4所示，與正常組相比，OGD組細(xì)胞中兩種mRNA水平均明顯提高(P<0.01)；經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑Rapa可上調(diào)LC3、P62 mRNA表達(dá)(P<0.05vsOGD)；而BCF及3-MA干預(yù)明可明顯降低LC3、P62 mRNA水平(P<0.05vsOGD)。

3.6 BCF對自噬通量的影響為進(jìn)一步研究BCF對自噬通量的影響，我們使用自噬溶酶體抑制劑—CQ作為對照。結(jié)果如Fig 5所示，CQ干預(yù)組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升、P62表達(dá)增加、Cathepsin D表達(dá)減少(P<0.05vsOGD)；而BCF干預(yù)可明顯下調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比例及Cathepsin D表達(dá)，上調(diào)P62表達(dá)(P<0.05vsOGD)。有意思的是，與單用CQ相比，聯(lián)合應(yīng)用BCF與CQ可同時下調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Cathepsin D蛋白表達(dá) (P<0.05)，初步提示BCF預(yù)處理可以影響自噬的發(fā)生發(fā)展，而并非只作用于其中某一環(huán)節(jié)。

4 討論

急性心肌梗死是以動脈供血障礙、出量減少及缺血性心肌壞死為主要病理特征的心血管常見急癥，常并發(fā)心力衰竭，病情兇險、致死率高。臨床主要通過手術(shù)或冠脈介入術(shù)恢復(fù)心臟血流供應(yīng)，但隨之而來的缺血/再灌注損傷制約著整體治療效果。另一方面，硝酸甘油、ACEI類藥物、β阻滯劑等雖可減輕心肌缺血損傷，但副作用較大[12]。近年來，從活血化瘀類中藥中提取的天然活性成分在細(xì)胞、動物缺血性心腦血管疾病模型中表現(xiàn)出良好的治療前景，為缺血性心腦血管疾病的防治提供了新的思路。BCF是九龍?zhí)俚闹饕钚晕镔|(zhì)，課題組前期報道了BCF在動物心肌缺血/缺灌注損傷與心肌梗死疾病模型中的治療作用[6-8]，本研究旨在探討B(tài)CF對體外心肌缺血/缺氧損傷的抑制作用及潛在機(jī)制。

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsOGD group

H9c2大鼠心肌細(xì)胞OGD模型常用于體外模擬心肌缺血/缺氧損傷[13]。cTnI和CK-MB是臨床上兩種最具代表性的心肌壞死血清生物標(biāo)志物，其含量與心肌損傷程度呈正相關(guān)。本研究通過構(gòu)建OGD模型研究BCF對心肌缺血/缺氧損傷的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCF干預(yù)可明顯改善缺氧心肌細(xì)胞形態(tài)，提高細(xì)胞活力，降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cTnI與CK-MB含量，有效減輕缺血/缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

自噬是一種高度保守的生理現(xiàn)象，可降解細(xì)胞內(nèi)老化細(xì)胞器及受損蛋白等大分子物質(zhì)。在正常情況下，細(xì)胞很少發(fā)生自噬，而饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺血/缺氧、細(xì)胞老化、細(xì)胞器損傷等是自噬常見的誘導(dǎo)因素[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬作為心臟在缺氧缺血損傷下心肌細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，一定程度的自噬對心肌細(xì)胞的存活具有保護(hù)作用，而長期嚴(yán)重缺氧引起的過度自噬可能會加速多種缺血性心臟病的發(fā)展[16-17]，因此，抑制自噬可能是治療此類疾病的一個策略。

Fig 4 Effect of BCF on mRNA expression of LC3 and P62 in OGD treatment cardiomyocytes n=6)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsOGD group

Fig 5 Effect of BCF on protein expression of LC3, P62 and Cathepsin D in cardiomyocytes

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsOGD group;△P<0.05vsOGD +CQ group

我們利用串聯(lián)熒光標(biāo)記LC3的腺病毒感染心肌細(xì)胞，觀察BCF對自噬體及自噬溶酶體形成的影響[11]。在串聯(lián)熒光體系中，黃色熒光斑點(diǎn)提示自噬體，紅色熒光斑點(diǎn)指示自噬溶酶體。結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體的形成明顯上升，提示OGD處理可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生發(fā)展；而BCF預(yù)處理組中，兩種熒光斑點(diǎn)數(shù)量明顯減少，其中，黃色熒光斑點(diǎn)的減少提示BCF對自噬體的形成具有抑制作用，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了此推斷，但紅色熒光的減少可能是自噬上游被抑制所導(dǎo)致，那么，BCF對自噬溶酶體形成有何影響？

基于此，課題組使用自噬溶酶體抑制劑—CQ為對照，進(jìn)一步探究BCF對自噬通量的影響。結(jié)果顯示，CQ干預(yù)組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/I水平上升，自噬體數(shù)量增加。由于自噬是一個持續(xù)動態(tài)的過程，所以CQ組細(xì)胞中自噬體的積聚進(jìn)一步證明OGD誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，而BCF干預(yù)使LC3-Ⅱ/I及Cathepsin D表達(dá)降低、P62增加。另一方面，BCF與CQ聯(lián)用逆轉(zhuǎn)了CQ導(dǎo)致的自噬體積聚、增強(qiáng)了對Cathepsin D的抑制，說明BCF可通過抑制自噬體形成及溶酶體活性等多個環(huán)節(jié)影響自噬的發(fā)生發(fā)展，具體的機(jī)制研究還有待進(jìn)一步深入。

綜上所述，本研究表明BCF預(yù)處理能有效改善心肌細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，減少cTnI、CK-MB外漏，抑制過度自噬，減輕心肌缺血/缺氧損傷。