王 娟，李芳瓊，張枝倩，王 偉

(1. 浙江省立同德醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310012；2. 浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)學院，浙江 杭州 310053)

雷公藤甲素(triptolide，TP)是從雷公藤中分離出的活性較高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，又名雷公藤內(nèi)酯醇，是雷公藤的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)TP在體內(nèi)外實驗中均顯示良好抗腫瘤活性，并且TP對腫瘤的抑制作用相當廣譜。TP可通過多種機制誘導多種腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞周期，包括卵巢癌[1]、胰腺癌[2]、乳腺癌[3]、肝癌[4]和肺癌[5]等來源的腫瘤細胞株。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，TP可通過激活caspase-3/9、增加Bax/Bcl的比率和促使線粒體釋放細胞色素C進而誘導肺癌細胞凋亡[6]。目前，關(guān)于TP誘導凋亡和抑制細胞周期的分子已經(jīng)研究得較為深入，但從核糖體生物合成的角度探討雷公藤甲素抑制腫瘤的研究還未見報道。

在我們前期研究中，利用同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標記后的質(zhì)譜檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，TP作用于A549非小細胞肺癌細胞后， 肝細胞癌抗原(hepatocellular carcinoma antigen 66，HCA66)的表達明顯下降[7]。HCA66作為核糖體生物合成網(wǎng)絡(luò)的重要組分，它在TP抑制肺癌細胞中的作用目前還未見報道。為進一步探討HCA66在TP抑制肺癌細胞中的作用，我們將在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步通過干擾HCA66的表達，檢測核糖體18S的合成變化，利用析18S的生物合成，探索TP抑制肺癌的作用機制，為TP治療肺癌提供科學的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 非小細胞肺癌A549細胞系由姚航平教授(浙江大學)饋贈。

1.1.2藥物與化學試劑 雷公藤甲素購買自美國Sigma Aldrich(T3652)公司，用二甲基亞砜溶解成100 μg·L-1的儲存液后，分裝保存于-80 ℃冰箱，實驗前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。DMEM高糖培養(yǎng)液、青霉素鏈霉素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、L-谷氨酸、胎牛血清從Gibco公司購買。TRIzol試劑和Lip2000(Thermo Fisher Scientific，11668019)；HCA66抗體(Proteintech，17671-1-AP)；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑(TAKARA BIO INC，RR047A和DRR041A)；蛋白提取液(Cell Signaling Technology，Inc. 9803)；細胞周期和凋亡試劑(北京聚合美生物科技有限公司，MF474-01和MF123-01)。

1.1.3實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；熒光定量PCR儀器(Bio-Rad Laboratories, Inc)；Western blot電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；流式細胞儀(Beckman Coulter)；顯影儀(上海勤翔科學儀器有限公司)

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) A549細胞為貼壁細胞，由包含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，該培養(yǎng)液同時包含：1%青霉素-鏈霉素、1%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酸。細胞接種后，置于包含5% CO2且恒溫為37 ℃的濕潤培養(yǎng)箱中。

1.2.2RNA 提取收集預(yù)處理好的細胞，離心去上清后加入1 mL TRIzol混勻裂解以使核蛋白體與RNA解離，加入200 μL氯仿，劇烈渦旋震蕩后，室溫靜置3 min，在4 ℃低溫離心中以12 000×g離心15 min。吸取上層包含RNA的無色透明水相，以等體積的異丙醇混勻，室溫靜置10 min，離心去上清，以75%(V/V)的乙醇洗滌沉淀，再次離心后棄上清，所得白色小團塊即為RNA沉淀，敞開EP管蓋，置于通風櫥中通風5 min，以使殘留的乙醇充分揮發(fā)后，加入適量DEPC水溶解RNA，并檢測RNA濃度。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 根據(jù)RNA濃度計算逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需RNA的體積。每10 μL反應(yīng)體系中RNA總量為500 ng。在每組反應(yīng)體系中，取適量體積的RNA溶液，加入去DNA緩沖液并在42 ℃水浴箱中孵育2 min以去除RNA的中殘留DNA。然后在每10 μL的反應(yīng)液中加入4 μL無RNA酶水、4 μL 5×PrimeScript反應(yīng)緩沖液、1 μL RT引物混合液、1 μL PrimeScript RT 酶混合液。最后在37 ℃反應(yīng)15 min；85 ℃反應(yīng)5 s。

1.2.4RT-PCR 為保持反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，反應(yīng)體系為50 μL，其中2×預(yù)混液25 μL，正向引物和反向引物各1 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物模板DNA1 μL，DEPC水22 μL，混合均與離心后，置于擴增儀上擴增，其反應(yīng)步驟如下：95 ℃×3 min；95 ℃×15 s；56 ℃×25 s；70 ℃×30 s；讀板；40個循環(huán)反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析：以人GAPDH基因為內(nèi)參，采用相對定量2-△△Ct計算相對于內(nèi)參的倍數(shù)，然后做統(tǒng)計分析。

引物序列如下：

PrimerSequence18S RNAForward5′-CGACGACCCATTCGAAC GTCT-3′Reverse5′-CTCTCCGGAATCGAACCCTGA-3′GAPDHForward5′-AGCCACATCGCTCAGAACAC-3′Reverse5′-GAGGCATTGCTGATGATCTTG-3′

1.2.5蛋白質(zhì)提取及免疫印跡 預(yù)處理好的細胞經(jīng)消化離心后，用預(yù)冷PBS洗滌3次，根據(jù)細胞數(shù)量加入1×蛋白提取液混勻并在冰上孵育30 min，低溫離心機中以12 000×g離心10 min。吸取上清并與上樣緩沖液混勻后，沸水中10 min。配制8%(Acr-Bis)分離膠和濃縮膠后進行等量上樣，配制快速電泳液，接通電源進行電泳，140 V電泳30 min。電泳結(jié)束后進行切膠轉(zhuǎn)膜，在恒流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉封閉1 h，清洗液(Tris-Buffered Saline Tween-20，TBST)在搖床上清洗4次，每次5 min。再次將聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)與二抗稀釋液孵育1 h，TBST清洗液清洗5次，配制顯色混合液，PVDF膜與顯色液孵育30 s后，在成像儀上顯影。

1.2.6細胞轉(zhuǎn)染 在A549細胞融合率為80%準備轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)液提前30 min換為無血清和抗生素的opti-MEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher Scientific，31985070)。分別用opti-MEM稀釋載體或siRNA和lip 2000脂質(zhì)體后，混合均勻并室溫放置20 min，將混合液逐滴加入細胞中，培養(yǎng)5h后換成全培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白質(zhì)。靶向HCA66的siRNA序列：5′-(CCAGCUUUGUGGAUUAUGG)dTT-3′(結(jié)合421-439位核苷酸)；對照siRNA序列：5′-(CGUUUAUUAUGAGCUGCGG)dTT-3′。HCA66過表達載體pHCA66購買自美國Origene公司(SC113508)。

1.2.7細胞凋亡 采用Annexin V-FITC /PI雙標法：用不含EDTA的胰酶消化預(yù)處理的細胞后，用PBS洗滌細胞2次，使每組細胞數(shù)量為5×105，在每組中加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加5 μL Annexin V-FITC，充分混勻后，加入5 μL PI混勻并在室溫避光孵育15 min，然后在流式細胞儀上檢測。

1.2.8細胞周期 胰酶消化收集預(yù)處理好的細胞后，PBS洗滌細胞并重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1×109·L-1。在1×106個細胞中加入預(yù)冷的70%的乙醇，4 ℃過夜固定后，去掉固定液并用預(yù)冷的PBS清洗細胞兩次，用100 μL RNase A溶液重懸細胞，混勻后在37 ℃水浴箱中孵育30 min，加入400 μL PI(Propidium Iodide)，充分混勻染色，4 ℃避光反應(yīng)30 min。流式細胞儀上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素作用肺癌細胞A549后HCA66的表達變化課題組前期分別以不同濃度的TP作用肺癌細胞A549后，利用質(zhì)譜技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)HCA66表達明顯下降，為進一步確認這一結(jié)果，我們利用免疫印跡技術(shù)再次驗證了TP作用A549細胞后HCA66的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25 μg·L-1TP作用于A549細胞36 h后，HCA66的表達明顯下降(P=0.0261)，加大TP的濃度至50 μg·L-1后，HCA66的表達進一步以降低(P=0.0056)，而當TP濃度為100 μg·L-1時，HCA66的的表達雖然明顯下降(P=0.0015)，但與50 μg·L-1的作用濃度相比，差異不明顯 (Fig 1)。

2.2 雷公藤甲素和HCA66對18SRNA的表達影響18S RNA作為核糖體的亞基之一，在調(diào)控細胞生長發(fā)育和病理進展中發(fā)揮做重要作用，它表達的改變會引起一系列病理變化[8]。在本研究中，以50 μg·L-1的TP作用與A549細胞36 h后，檢測18S RNA的表達改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)18S RNA的表達顯著下降(P=0.0062)(Fig 2A)。為研究HCA66對18S RNA的影響，我們首先利用SiRNA干擾HCA66后，以免疫印跡技術(shù)確認HCA66表達，結(jié)果證實HCA66的表達明顯下調(diào)，進一步在HCA66干擾的細胞中檢測18S RNA的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCA66干擾后，18 SRNA的表達明顯下降(P=0.0162)(Fig 2B)。

Fig 2 Effects of triptolide and HCA66protein on 18S RNA synthesis

A:Effect of TP on 18S RNA expression; B: Effect of interfered HCA66 on 18S RNA expression.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 過表達HCA66削弱TP對18S RNA作用為進一步研究HCA66在TP抑制肺癌細胞中的作用機制，我們在A549細胞中將HCA66進行過表達，結(jié)果證實轉(zhuǎn)染HCA66過表達載體后，HCA66的表達明顯增加(Fig 3A)。在TP處理的A549細胞中，同時將HCA66進行過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP處理后18S RNA 明顯下降(P=0.059)，與Fig 2結(jié)果相符，但在TP處理的細胞中將HCA66進行過表達，與TP作用組相比，18S RNA的產(chǎn)生明顯增加(P=0.017)，表明HCA66的過表達部分逆轉(zhuǎn)了TP對18S RNA的抑制作用。

Fig 3 The inhibitory effect of TP on 18S RNAattenuated by HCA66 overexpression

A: HCA66 overexpression in A549 cells; B: The combined effect of TP and HCA66 overexpression on 18S RNA.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsTP 25 μg·L-1

2.4 過表達HCA66削弱TP對肺癌細胞的抑制作用目前TP通過誘導凋亡和阻滯細胞周期來抑制肺癌細胞的作用已被廣泛認可，在課題組前期研究中也到得到了證實。鑒于HCA66對TP抑制18S的部分逆轉(zhuǎn)作用，同時核糖體合成的紊亂與細胞周期和凋亡密切相關(guān)。因此我們利用流式細胞術(shù)檢測過表達HCA66對TP誘導細胞凋亡和周期阻滯的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，25 μg·L-1TP作用A549細胞后，能明顯誘導細胞凋亡，在TP作用的同時將HCA66進行過表達，發(fā)現(xiàn)TP的凋亡誘導作用減弱(Fig 4A)。當用25 μg·L-1TP作用A549細胞后，與對照相比，細胞周期被阻滯在G2期，HCA66過表達后，阻滯在G2期的細胞減少。表明HCA66削弱了TP對A549細胞的凋亡誘導和周期阻滯作用。

3 討論

目前國內(nèi)外研究者對TP在腫瘤細胞中的作用已進行了大量的研究和報道。發(fā)現(xiàn)TP除了可以通過抑制腫瘤細胞周期、誘導細胞凋亡和自噬性死亡的方式來殺死腫瘤細胞，還能有效增強抗癌藥物的敏感性[9]。項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，TP可與羥基喜樹堿協(xié)同作用借助PP2A調(diào)節(jié)的ERK/p38 MAPK/Ak信號通路來誘導非小細胞肺癌細胞凋亡[6]。進一步以TP單獨刺激A549細胞后，TP能以劑量依賴的方式誘導非小細胞肺癌細胞凋亡和將細胞周期阻滯在G2期，用iTRAQ標記后進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，與核糖體生物合成相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白普遍下調(diào)，其中HCA66下調(diào)較為顯著[7]。在本研究中，繼續(xù)利用蛋白免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TP作用于肺癌細胞后，HCA66的蛋白表達量明顯下降，但不具有濃度依賴性，可能是由于加大TP的濃度后，TP的毒性作用掩蓋了對HCA66的抑制。

HCA66最初作為中心體的一個組成部分而被發(fā)現(xiàn)，并被證明是中心粒復制和雙極紡錘體的形成所必需的，以確保在有絲分裂期間正確的染色體分離[10]，提示HCA66與細胞周期的密切關(guān)系。在后續(xù)的研究中，逐漸發(fā)現(xiàn)HCA66在核仁中明顯聚集，表明HCA66可能與核糖體生物合成有關(guān)。后續(xù)的研究證實，干擾HCA66表達后，在核糖體前體RNA加工過程發(fā)生障礙，導致成熟的18S RNA不能正常產(chǎn)生[11]，從而干擾核糖體正常的生物合成。而干擾核糖體的生物合成可以抑制腫瘤細胞生長和誘導凋亡的發(fā)生[12-13]。在臨床疾病的研究中，目前HCA66僅在神經(jīng)纖維瘤中有相關(guān)報道，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)纖維瘤患者中存在HCA66的雜合缺失[14]，表明在正常細胞中HCA66的劑量不足將會導致核糖體合成缺陷并進一步導致一些伴隨疾病的發(fā)生，雷公藤甲素可能正是利用這一機制來抑制肺癌細胞。在本研究中，我們嘗試在A549細胞中將HCA66進行部分干擾后，發(fā)現(xiàn)18S的合成明顯減少，結(jié)合TP能下調(diào)HCA66蛋白表達這一實驗結(jié)果，表明TP可能通過下調(diào)HCA66的表達來抑制18S RNA 的產(chǎn)生。為進一步證實這一結(jié)果，我們在TP刺激的肺癌細胞中將HCA66進行過表達，發(fā)現(xiàn)TP對18S的抑制效應(yīng)明顯減弱，TP對肺癌細胞的凋亡誘導和周期阻滯作用明顯下降，表明過表達HCA66部分逆轉(zhuǎn)了TP對18S的抑制作用。然而，過表達HCA66并未完全逆轉(zhuǎn)TP對18S的抑制效應(yīng)，表明TP很有可能還通過其他機制來抑制18S的產(chǎn)生，因此TP通過核糖體的抑制作用來殺滅肺癌細胞還需要進一步更深入的研究。

Fig 4 The inhibitory effect of TP on apoptosis and cell cycle attenuated by HCA66 overexpression

A:The combined effect of TP and HCA66 overexpression on apoptosis; B: The combined effect of TP and HCA66 overexpression on cell cycle

通常成熟的核糖體主要定位在胞質(zhì)和胞質(zhì)膜系統(tǒng)上，它由60S大亞基和40S小亞基組成。其中，18S RNA是40S小亞基的RNA組分，18S的早期加工需要HCA66的參與。在核糖體初始RNA轉(zhuǎn)錄過程中，HCA66協(xié)同其他重塑因子(assembly factors，AFs)包括UTP12、UTP21、UTP18等共同組成UTP-B(U three proteins)復合體的核心組分參與早期核糖體40S小亞基加工過程[15]。干擾HCA66的表達明顯減少40S小亞基生成，而HCA66的低表達卻并不影響大亞基相關(guān)的32S中間體和28S成熟體的產(chǎn)生[11]。表明雖然HCA66只參與核糖體的早期加工過程，但是它的表達異常卻直接影響到成熟18S RNA的產(chǎn)生，這與我們本研究結(jié)果相一致。

由于核糖體加工過程的復雜性，目前關(guān)于核糖體加工機制的發(fā)現(xiàn)還較為局限，因此還需開展更多的研究去分析核糖體和加工及成熟分子機制，進一步研究雷公藤甲素對核糖體合成的干擾及分子機制，為雷公藤甲素的臨床應(yīng)用提供科學的理論依據(jù)。