周 鴻，鄭麗婷，林愛華，劉奕明，3

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.Ⅰ期臨床研究室,2.珠海醫(yī)院藥劑科,3.廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510120)

知母為百合科植物知母(anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根莖[1]，具有清熱瀉火，生津潤燥的作用[2]。芒果苷(mangiferin，MGF)是其主要藥效成分之一，是一種糖基化黃酮，屬天然多酚類化合物，分子式C19H18O11，分子量M=422.33[3]，具有多種生物活性，如降血糖[4]、抗氧化[5]等。知母給藥芒果苷血藥濃度明顯高于單體給藥，配伍黃柏后明顯降低[6]，而在胰腺組織配伍黃柏后芒果苷濃度明顯升高[7]，可見組織和血漿中的濃度變化并不一致?；谘獫{藥物濃度的經(jīng)典藥代動力學(xué)研究并不能完全解釋藥物在一些組織中的作用[8]。相比而言，細胞內(nèi)藥物濃度比血藥濃度更加能真實地反映藥效，研究細胞內(nèi)的藥物濃度變化過程可能比血藥濃度對解釋藥物作用更有直接的意義[9]。關(guān)于芒果苷的藥動學(xué)研究較多[10-12]，但其在細胞中的藥代動力學(xué)尚未見報道。因此本文選擇INS-1細胞，探討低、中、高不同劑量芒果苷在INS-1細胞的藥代動力學(xué)特征，在同劑量下比較其在氧化損傷模型細胞與正常細胞的藥動學(xué)差異，為進一步解釋芒果苷的降糖作用機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑芒果苷對照品(批號111607-200301，純度HPLC>98%)中國藥品生物制品檢定所；蘆丁對照品(批號O0714AS，純度HPLC>98%)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液，美國Hyclone公司；過氧化氫(H2O2)、噻唑藍(MTT)粉末、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、青/鏈霉素溶液(雙抗)、南美胎牛血清、0.25%胰酶均來自美國Gibco公司；冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(美國默克公司)均為HPLC色譜純；水為Milli-Q超純水。

1.2 主要儀器QTRAP6500+型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，配備SHIMADZU LC-30A高效液相色譜(日本島津公司)、Turbo Ionspray離子源(ESI)及Analyst1.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)；BF2000-30A氮氣吹干儀(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；Allegra X-22R型多功能臺式離心機(美國Beckman Coulter公司)；Victor X5酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)；AB135-S電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Sonics VCS105型超聲波細胞破碎儀(美國Sonics公司)。

1.3 實驗細胞INS-1為大鼠胰島素瘤細胞，購于北京北納生物科技有限公司。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件色譜條件色譜柱Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；洗脫方式：梯度洗脫；流動相A為1%冰乙酸水，流動相B為甲醇，0～2.0 min：20% B相；2.0～4.0 min：20%～70% B相；4.0～4.5 min，70%～20% B相；4.5～7.0 min，20% B相；總分析時間：7.0 min；流速：300 μL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。前2.0 min和最后0.5 min進廢液。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧(ESI)源；霧化溫度：400 ℃；噴霧電壓(IS)：5 000 V；氣簾氣(CUR)：25 psi；碰撞氣(CAD)：6 psi；氮氣1(GS1)：55 psi；氮氣2(GS2)：55 psi。檢測方式為正離子多離子反應(yīng)(MRM)監(jiān)測，用于定量分析的離子對分別為：m/z 423.0→273.2(芒果苷)；m/z 611.5→303(內(nèi)標(biāo)蘆丁)。

2.2 溶液的制備稱取芒果苷對照品10.00 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成濃度為400 mg·L-1的芒果苷儲備液，-20 ℃冷藏備用。使用時以40%甲醇水稀釋至適當(dāng)濃度的對照品工作液。稱取蘆丁(IS)對照品1.09 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成濃度為109 mg·L-1的儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時以40%甲醇水稀釋至終濃度為218 μg·L-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 細胞樣品采集將生長至對數(shù)期的細胞，種于24孔板，每組每個時間點6孔，每孔約1.0×105個細胞，孵育24 h后分別給藥50、100、500 μmol·L-1MGF，給藥前取空白細胞，給藥后分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h收集細胞，PBS緩沖液清洗3遍后，加入120 μL經(jīng)滅菌處理過的超純水，反復(fù)凍融3遍后超聲裂解細胞。放于-80 ℃保存。

另將生長至對數(shù)期的細胞，種于12孔板，每孔約3.0×105個細胞，設(shè)置對照組和模型組，每組每個時間點6孔，孵育24 h后模型組加入1 mL 140 μmol·L-1H2O2進行氧化損傷造模，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基。造模1 h后，吸取上清丟棄，均給藥1 mL 100 μmol·L-1MGF，給藥前取空白細胞，給藥后分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h收集細胞，PBS緩沖液清洗3遍后，加入120 μL經(jīng)滅菌處理過的超純水，反復(fù)凍融3遍后超聲裂解細胞。放于-80 ℃保存。

2.4 細胞樣本處理取出凍存樣品于冰面上融化后，震蕩3 min，4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min。取5 μL上清，加入15 μL超純水，再加入200 μL蛋白工作液，置于37 ℃恒溫箱里孵育25 min。用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定OD值，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白濃度，再固定蛋白量至0.5 g·L-1。取100 μL固定蛋白量的細胞裂解樣品，加入內(nèi)標(biāo)(218 μg·L-1)10 μL，混勻后加入400 μL乙腈 ∶乙酸(40 ∶1)，震蕩3 min，14 800 r·min-1離心10 min，取400 μL上清氮氣吹干，殘渣加200 μL 40%甲醇復(fù)溶，震蕩3 min，14 800 r·min-1離心10 min，取上清過膜，進行LC-MS/MS分析。

3 結(jié)果

3.1 專屬性分別取6份空白細胞、空白細胞加MGF對照品和內(nèi)標(biāo)以及給藥MGF后的生物樣品，按照“2.4”項下操作，在選定檢測條件下考察2種分析成分，F(xiàn)ig 1結(jié)果顯示，MGF和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為4.18和4.36 min，細胞中內(nèi)源性物質(zhì)不會對待測成分產(chǎn)生干擾，峰型良好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限精密吸取適當(dāng)濃度的MGF對照品工作液適量，分別加入適量空白細胞裂解樣品，配制成MGF終濃度為2、5、10、20、50、100、200、500 μg·L-1的系列細胞標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。按“2.4”項下方法處理，進行LC-MS/MS法分析。以待測分析物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)和細胞藥物濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(權(quán)重1/X2)，進行線性回歸方程。實驗結(jié)果顯示該檢測方法中MGF在細胞中線性濃度范圍為2～500 μg·L-1，定量下限為2 μg·L-1；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0065X+0.0313(r=0.9965)，表明線性關(guān)系良好。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度配制定量下限、低、中、高(2、5、50、400 μg·L-1)4個濃度MGF質(zhì)控樣品，按“2.4” 項下方法處理，每個濃度6份樣品同1 d內(nèi)制備并測定，連續(xù)制備并測定3 d，通過每天隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定質(zhì)控樣品的質(zhì)量濃度，以日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)考察方法精密度，以實測濃度與真實濃度相比得相對回收率表示準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示MGF的準(zhǔn)確度在93.97%～103.54%，日內(nèi)精密度RSD均≤9.40%，日間精密度RSD均≤14.49%，均符合生物樣品分析的方法學(xué)要求，見Tab 1。

Tab 1 Accuracy and precision for analysisof MGF in QC

3.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)配制低、中、高3個濃度芒果苷5、50、400 μg·L-1的質(zhì)控樣品，每個濃度6份樣品，按“2.4” 項下方法處理，進樣分析得峰面積A1；配制低、中、高3個濃度的對照品溶液，另取空白細胞，按“2.4”項下操作，氮氣吹干后，殘渣分別用含2.5,25,200 μg·L-1質(zhì)量濃度MGF的甲醇水(40 ∶60)復(fù)溶，進樣分析，得峰面積A2；直接用含2.5,25,200 μg·L-1質(zhì)量濃度MGF的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣分析，得峰面積A3。以A1與A2的的比值計算提取回收率，A2與A3比值計算基質(zhì)效應(yīng)，見Tab 2。

3.5 穩(wěn)定性分別配制MGF低、中、高3個濃度5、50、400 μg·L-1的質(zhì)控樣品，每個濃度6份樣品，考察在下述條件中MGF的穩(wěn)定性：細胞樣品在室溫放置3 h后處理并測定(室溫穩(wěn)定性)；細胞樣品經(jīng)-80 ℃反復(fù)凍融3次后處理并測定(凍融穩(wěn)定性)；制備好的待測液在4 ℃進樣器里放置24 h后測定(待測液穩(wěn)定性)；在-80 ℃冰箱中放置30 d后處理并測定(長期穩(wěn)定性)，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)控濃度，并計算準(zhǔn)確度，見Tab 3。表明在上述條件下MGF均能保持穩(wěn)定。

3.6 芒果苷在INS-1細胞中藥代動力學(xué)特征INS-1細胞單次給藥低、中、高(分別為50,100和500 μmol·L-1)劑量MGF后，在6.50～10.33 h內(nèi)達到濃度峰值，其中低中高劑量Cmax分別是55.30±25.49、103.35±42.47、458.33±80.03 μg·L-1。 AUC(0-t)分別1 501.58±309.05、2 188.04±499.53、13 215.58±907.81 μg·L-1,見Fig 2，Tab 4。

Tab 2 Extraction recovery and matrix effect of MGF cells in QC

Fig 1 Representative MRM chromatograms of(A) Blank cell lysis sample;(B) Blank cell lysis spikedwith MGF(LLOQ) and IS(218 μg·L-1); and(C) Cell lysis obtained from INS-1 cells after administration of mangiferin

Ⅰ: MGF(m/z 423.0→273.2);Ⅱ: IS(m/z 611.5→303)

Tab 3 Stability data of mangiferin in QC

Tab 4 Pharmacokinetic parameters of mangiferin after single dose administration of low, medium and high dose of

AUC(0-t)和Cmax隨給藥劑量的增加而增加。AUC(0-t)經(jīng)劑量校正后(AUC(0-t)/Dose)經(jīng)方差分析，低、中劑量組間有顯著性差異(P<0.05)，其他劑量組間差異無顯著性(P>0.05)。Cmax經(jīng)劑量校正后(Cmax/Dose)經(jīng)方差分析，3個劑量組間無顯著性差異(P>0.05)，表明Cmax隨劑量升高而成比例升高，見Fig 3。在50～500 μmol·L-1劑量內(nèi)，MGF在INS-1細胞內(nèi)未表現(xiàn)線性藥代動力學(xué)特征。

Fig 2 Mean drug concentration-time curvesof mangiferin within 48 hours after single administration ofmangiferin 50, 100, 500 μmol·L-1(n=6)

3.7 MGF在INS-1細胞不同病理狀態(tài)下的藥代動力學(xué)特征正常組(Control, CON)和造模組(Model, MOD)單次給藥芒果苷100 μmol·L-1劑量后芒果苷的藥時曲線和藥代動力學(xué)參數(shù)見Fig 4，Tab 5。芒果苷給藥后，正常和造模組INS-1細胞的Tmax分別為12.00±6.57 h和9.67±2.94 h，Cmax分別為454.83±45.46和334.00±35.06 μg·L-1；AUC(0-t)分別為13 289.23±1 080.58和9 349.89±1 101.36 μg·L-1。模型組INS-1細胞的Cmax和AUC(0-t)明顯低于正常組INS-1細胞(P<0.01)。

Fig 3 Correlation between AUC(0-t) Cmax,and doseadministered after single dose of MGF at low, medium andhigh(50, 100 and 500 μmol·L-1) doses to INS-1 cells

Fig 4 Mean drug concentration-time curvesof mangiferin within 48 hours after single administration of100 μmol·L-1 mangiferin in normal and model INS-1 cells(n=6)

Tab 5 Pharmacokinetic parameters ofmangiferin after single dose administration of 100 μmol·L-1mangiferin in normal and model INS-1

*P<0.05,**P<0.01vsCON

4 討論

本文建立了LC-MS/MS測定INS-1細胞中芒果苷含量的分析方法，以1%冰醋酸-甲醇為流動相進行梯度洗脫，該方法測得目標(biāo)成分的內(nèi)源性雜質(zhì)干擾小，峰形對稱，分離度好；采用正離子多離子反應(yīng)檢測，質(zhì)譜響應(yīng)及靈敏度高。在樣品前處理條件優(yōu)化中，比較了不同的細胞裂解方法(RIPA細胞裂解液法、超聲聯(lián)合反復(fù)凍融法)，并進一步考察加入乙腈 ∶乙酸(V/V40 ∶1)，離心取上清，氮氣吹干后復(fù)溶，對待測物響應(yīng)值的影響，最終確定使用超聲聯(lián)合反復(fù)凍融的方法裂解細胞。

本課題組前期研究表明，在H2O2氧化損傷模型中，INS-1與140 μmol·L-1H2O2孵育1 h后，存活率約為50.58%(P<0.01)，最接近半數(shù)致死量，因此選擇該濃度作為誘導(dǎo)INS-1細胞氧化損傷的條件。另外，MGF低中高給藥劑量不僅能抑制H2O2引起的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS和MDA升高，而且還可以改善線粒體膜電位[13]，這與MGF體內(nèi)抗氧化研究的結(jié)果一致[14]。因此，本文選取此低中高濃度作為研究對象，考察不同劑量下芒果苷在INS-1細胞的藥代動力學(xué)特征，并以中劑量(100 μmol·L-1)為例，探究同劑量下正常組和模型組的藥代動力學(xué)參數(shù)。

MGF低中高劑量在INS-1細胞中給藥后，MGF的Cmax和AUC與劑量呈正相關(guān)，隨著劑量的增大，Cmax和AUC也呈增加趨勢。MGF在INS-1細胞和體內(nèi)[15]相比，達峰時間Tmax有所推遲，半衰期T1/2延長，表明不同環(huán)境下芒果苷的藥代動力學(xué)并不一致，推測可能與體內(nèi)外的微環(huán)境不同有關(guān)。在同一劑量(100 μmol·L-1)給藥時，模型組INS-1細胞的Cmax和AUC(0-t)明顯低于正常組INS-1細胞，提示氧化損傷的INS-1細胞對芒果苷的吸收明顯減少，而半衰期T1/2則明顯增加，表明MGF在病理模型INS-1細胞中藥代動力學(xué)發(fā)生明顯變化。

本文建立了靈敏、快速和簡便的LC-MS/MS法測定MGF，基于該方法測定INS-1細胞內(nèi)單次給藥MGF后，在INS-1細胞內(nèi)藥時曲線特征，為其在細胞內(nèi)研究作用靶點奠定了基礎(chǔ)，對進一步闡明其藥理作用機制具有重要意義。