陳 晨，張 媛, 吳彥霖, 楊澤岸, 胡文言,蔡 彤, 高 華

(1.中國食品藥品檢定研究院化藥所藥理室, 北京 102629; 2.中國生化制藥工業(yè)協(xié)會，北京 100068)

骨肽是一種具有新型生物活性的多組分生化藥，它的主要原料是新采集或冷凍保存的豬、胎?；蚵沟鹊墓趋?，經(jīng)生物技術(shù)提取，進(jìn)一步加工制成。其制備工藝為：取上述哺乳動物的四肢骨洗凈、破碎，通過加壓提取并合并提取液，調(diào)pH值至中性，經(jīng)濃縮、超濾等精制而成[1]。自上世紀(jì)中期，骨肽類藥物用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、促進(jìn)骨折愈合，治療關(guān)節(jié)炎等相關(guān)骨類疾病。

目前，骨肽注射劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于化學(xué)藥品地標(biāo)升國標(biāo)第十六冊，在組分研究中以蛋白質(zhì)含量作為質(zhì)控方法，采用福林酚法及氮測定法測定多肽含量和總氮量。該法對來源于動、植物中含有肽鍵的任何多肽均可產(chǎn)生正反應(yīng)，專屬性差[2]，不能全面地反映藥品的有效性，且骨肽來源于生物組織，成分復(fù)雜，藥效為多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用[3]?；诖耍谠|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，本研究以藥物的藥理作用及藥效學(xué)為研究基礎(chǔ)，建立關(guān)聯(lián)臨床功效的生物活性測定方法，并與理化分析方法相結(jié)合，達(dá)到全面綜合地評價藥品的安全性、有效性和質(zhì)量可控的目的。

臨床研究表明，骨肽類藥物治療骨質(zhì)疏松癥有顯著療效。FDA于1994年頒布的骨質(zhì)疏松癥指導(dǎo)原則《Guidelines For Preclinical and Clinical Evaluation of Agents Used in the Treatment or Prevention of Postmenopausal Osteoporosis (1994)》中提出，臨床前須采用動物實(shí)驗(yàn)來檢測骨質(zhì)疏松類藥物的有效性，指定動物模型為去卵巢大鼠模型[4]。此模型與臨床上絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松類似，是一種高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，由于體內(nèi)雌激素水平明顯降低，導(dǎo)致骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡被打破[5]，成骨細(xì)胞內(nèi)γ-CGS等抗氧化酶水平明顯降低，啟動級聯(lián)反應(yīng)，抑制成骨細(xì)胞活性，最終減弱骨形成作用。抑制活性氧(reactive oxygen species, ROS)的增多，促進(jìn)了破骨細(xì)胞生成，增加破骨細(xì)胞活性，最終造成骨丟失引起骨代謝異常[6-9]。

本實(shí)驗(yàn)以骨肽制劑原料藥(骨肽原液)為研究對象，以其臨床藥理作用為基礎(chǔ)，從藥效學(xué)出發(fā)，設(shè)計實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行分析，直觀地表現(xiàn)骨肽的生物活性，為骨肽藥物建立適宜的生物活性檢測方法。我們采用雙側(cè)摘除卵巢的大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，選取目前公認(rèn)的檢測指標(biāo)，評價骨肽原液對骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用，檢測其對骨密度、骨鈣骨磷的影響，觀察骨病理狀態(tài)，并檢測與成骨相關(guān)的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和破骨相關(guān)抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)指標(biāo)的變化。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物Wistar去卵巢模型大鼠96只，假手術(shù)大鼠8只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，SPF級，♀，合格證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(21～26) ℃，濕度為40%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器骨密度儀，Discovery，購于Hologic公司；多功能微板檢測儀酶標(biāo)儀，型號： SYNERGY HT，購于Biotek公司；高速離心機(jī)，6R，購于Beckman Coulter公司；分析天平，XPE26，購于Mettler Toledo公司；真空干燥箱，VD53，購于Binder；電感偶合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS), ICAP-Q，購于Thermo；趕酸器，BHW-09C，購于美國培安公司；微波消解儀，MARS-EXPRESS，購于美國培安公司；脫水機(jī)，VIP-6，購于日本櫻花公司；包埋機(jī)，KD-BM，購于科迪儀器設(shè)備有限公司；病理切片機(jī)，RM2016，購于德國徠卡公司；組織攤片機(jī)，KD-P，購于科迪儀器設(shè)備有限公司；烤片機(jī)，KPJ-14，購于天津愛華公司；顯微鏡，Nikon Ci-S，購于日本康尼公司；成像系統(tǒng)，DS-FI2，購于日本尼康公司；恒溫箱，DH3600，購于天津泰斯特儀器有限公司；載玻片及蓋玻片，188105，購于江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與樣品雌二醇片，購于DELPHARMLIlleS.A.S.,批號：398A；4%多聚甲醛，購于索萊寶，批號：20181220；硝酸，優(yōu)級純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20180425；鹽酸，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190428；抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒，購于碧云天，批號：091018181122；堿性磷酸酶檢測試劑盒，購于碧云天，批號：090718181102；鈣元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)200 mg·L-1，購于Inorganic，批號：M2-MEB664154；磷元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1 000 mg·L-1，購于Inorganic，批號：M2-P662227；無水乙醇，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20150917。骨肽原液樣品：10個廠家(廠家A-J)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥選取手術(shù)后的去卵巢模型Wistar大鼠，按體重隨機(jī)分為模型組、陽性對照組(雌二醇)及供試品組(1～10個廠家骨肽原液)；同來源同手術(shù)但不摘除卵巢的大鼠設(shè)為假手術(shù)組，每組8只，共計13組。各組給予藥物、給藥劑量及給藥方式見Tab 1。連續(xù)給藥12周，在最后一次給藥后禁食24 h。使用25 %氨基甲酸乙酯，給藥劑量為1 g·kg-1，給藥體積為4 mL·kg-1，腹腔注射麻醉大鼠后，取材后檢測。

2.2 指標(biāo)采集及檢測

2.2.1骨密度、骨鈣及骨磷檢測 麻醉后腹主動脈取血并處死大鼠，剝離左后肢股骨，盡量將軟組織剝離干凈，放入標(biāo)記好的離心管中保存?zhèn)溆谩?/p>

Tab 1 Rat grouping and administration (n=8)

骨密度檢測：取大鼠左腿股骨，置于37 ℃烘箱中干燥72 h后，使用骨密度儀，進(jìn)行骨密度測定。

骨恒重：取大鼠左腿股骨，經(jīng)骨密度測定后，進(jìn)行恒溫干燥，實(shí)驗(yàn)條件：105 ℃，72 h，放置干燥器中，室溫靜置30 min，精密稱定，再次進(jìn)行恒溫干燥，實(shí)驗(yàn)條件：105 ℃，1 h，室溫靜置30 min，精密稱定，至連續(xù)兩次稱量恒重，即誤差不超過0.5 mg。

骨鈣檢測：取大鼠左股骨樣品，精密稱量，分別放置在消解罐內(nèi)，加入硝酸5 mL，按程序要求進(jìn)行微波消解。微波消解后，取出消解罐，放置冷卻后開蓋，將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用一級純水沖洗消解罐及罐蓋，合并洗滌后定容，使用ICP-MS進(jìn)行測定。

骨磷檢測：取大鼠左股骨樣品，精密稱量，分別置于清洗好的聚氟乙烯消解罐內(nèi)，加入硝酸5 mL，浸泡不低于12 h，為使樣品充分浸沒，浸泡期間須晃動幾次消解罐，罐蓋旋緊后，將消解罐放置微波消解儀中，按程序要求進(jìn)行微波消解。微波消解后，取出消解罐，放置冷卻后開蓋，放入趕酸器中，實(shí)驗(yàn)條件：125 ℃，180 min。完畢后將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水沖洗消解罐及罐蓋，合并洗滌后定容，使用紫外分光光度計進(jìn)行測定。試劑空白為在不加入樣品的情況下，同等條件進(jìn)行檢測。

2.2.2骨組織病理檢測 取剝離右后肢股骨，盡量將軟組織剝離干凈，放置于4%多聚甲醛中固定。

組織切片：取3 mm厚的骨標(biāo)本，梯度酒精脫水，分別用70%、80%、95%、100%洗脫30 min，二甲苯兩瓶各洗脫20 min，石蠟浸蠟兩缸各洗脫12 min，包埋，切片4 μm，烤片。

蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色：(1) 脫蠟，3瓶二甲苯每瓶脫蠟8 min；2瓶100%酒精每瓶脫蠟8 min；分別使用90%酒精、80%酒精、60%酒精各脫蠟8 min。(2) 蘇木精染色4 min，流水清洗；(3) 鹽酸酒精分化2～3 s，流水清洗；(4) 0.5%氨水20 s，流水清洗后上鏡觀察。(5) 0.5%伊紅染色1 min；(6) 80%酒精、90%酒精各分化3～5 s；95%酒精分化5 min；3瓶100%酒精各分化5 min；2瓶二甲苯各分化5 min。(7) 中性樹脂膠封固；光鏡觀察并顯微照相。

切片計量分析與形態(tài)觀察：切片進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察及數(shù)字化全景掃描，骨形態(tài)學(xué)計量采用NDP掃描軟件。每個切片在骨組織四邊內(nèi)測量骨小梁面積、骨小梁數(shù)量以及骨小梁分離度。

2.2.3血清中ALP、TRACP活性檢測 使用血清分離膠真空采血管采集大鼠血液，室溫靜置30 min，以每分鐘3 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清，按照ALP、TRACP試劑盒說明書分別進(jìn)行血清中ALP、TRACP活性測定。

3 結(jié)果

3.1 對股骨骨密度、骨鈣、骨磷的影響

3.1.1骨密度檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組骨密度降低且差異具有顯著性(P<0.05)，表明造模成功。陽性對照組對增加骨密度作用明顯，與模型組相比差異具有顯著性，供試品組中6個廠家J、I、E、D、B、C的骨密度值均增加，并且差異具有顯著性，而其余4個廠家骨密度值在一定程度上增加，但差異不具有顯著性，結(jié)果見Fig 1。

Fig 1 Bone mineral density values in femoral center of

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.1.2骨鈣檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組骨鈣降低并差異具有顯著性，表明造模成功。與模型組相比，陽性對照組骨鈣值明顯增加，與模型組相比具有顯著性差異；供試品組中3個廠家I、J、C骨鈣含量增加，且具有顯著性，另外7個廠家在一定程度上增加骨鈣含量，但差異不具有顯著性，結(jié)果見Fig 2。

Fig 2 Bone calcium values in different groups of n=8)

**P<0.01vssham group；#P<0.05vsmodel group

3.1.3骨磷檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組骨磷降低，差異具有顯著性，表明造模成功。與模型組相比，供試品組中僅廠家C的骨磷含量增加，差異具有顯著性，陽性對照組及其余9個廠家骨磷含量與模型組相比差異均無顯著性。結(jié)果見Fig 3。

Fig 3 Bone phosphorus values in different groups of

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsmodel group

3.2 骨組織病理切片形態(tài)觀察與計量分析

3.2.1股骨病理計量分析 與假手術(shù)組相比，模型組骨小梁面積、數(shù)量、面積百分比均有一定程度降低，分離度有所增加，并且差異具有顯著性，表明造模成功。與模型組相比，陽性對照組及供試品組中廠家D的骨小梁面積、數(shù)量、面積百分比增加，分離度降低，差異具有顯著性；而其余9個廠家不同程度上增加骨小梁面積、數(shù)量、面積百分比，降低分離度，但差異無顯著性。結(jié)果見Fig 4。

Fig 4 Area, number, resolution, and area percentage of trabeculae in different groups of n=8)

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.2.2HE染色 大鼠股骨組織切片HE染色顯示，假手術(shù)組骨小梁相對粗壯且數(shù)量較多，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，脂肪細(xì)胞少，腔內(nèi)造血組織比例>50%，生長情況良好；與模型組相比，模型組骨小梁數(shù)量明顯減少而稀疏，且被大量脂肪細(xì)胞取代，骨小梁間距大，造血組織比例下降明顯，表明造模成功；與模型組相比，陽性對照組骨小梁數(shù)量增加，脂肪細(xì)胞相對減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對較好；各供試品組均優(yōu)于模型組，個別廠家達(dá)到了陽性組水平，其中以廠家D效果最為顯著。各組病理典型圖詳見Fig 5。

3.3 對血清中 ALP、TRACP活性的影響

3.3.1ALP檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組ALP活性增加且差異具有顯著性，表明高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥造模成功。與模型組相比，陽性對照組ALP活性明顯增加，差異具有顯著性；供試品組中廠家D、A、B、C、I、F的ALP活性增加，差異具有顯著性，而另外4個廠家在一定程度上增加ALP活性，但差異不具有顯著性。結(jié)果見Fig 6。

3.3.2TRACP檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組TRACP活性增加且具有顯著性差異，表明造模成功。與模型組相比，陽性對照組TRACP活性明顯降低，差異具有顯著性；供試品組中7個廠家H、B、D、G、J、C、 A的TRACP活性降低，差異具有顯著性，而另外3個廠家在一定程度上降低TRACP活性，但差異不具有顯著性。結(jié)果見Fig 7。

4 討論

骨密度測量是目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的診斷骨質(zhì)疏松的“金標(biāo)準(zhǔn)”，還可估計骨質(zhì)疏松的程度。對于骨質(zhì)疏松類藥物，它也是評價其療效的一種必要手段，具有較高的精密度、準(zhǔn)確度和檢測敏感度。其值能直接反映骨量變化程度，骨密度越大說明骨質(zhì)量和骨結(jié)構(gòu)越好。本研究表明，10個廠家的骨肽原液均能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度有一定程度的增加，其中6個廠家的骨肽原液在骨密度增加方面差異有顯著性。骨鈣與骨磷是骨礦物質(zhì)的主要成分，也是構(gòu)成骨的主要成分，其含量能間接反映骨中礦物質(zhì)含量，在一定程度上反映骨質(zhì)量。骨鈣和骨磷高，說明骨質(zhì)量越好。10個廠家的骨肽原液均能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨鈣、骨磷增加，其中3個廠家的骨肽原液在骨鈣增加方面差異有顯著性，1個廠家的骨肽原液在骨磷增加方面差異有顯著性。

Fig 5 HE staining of bone tissue sections in each group(10×)

ALP是臨床上常用的評價骨形成的重要指標(biāo)，活躍的成骨細(xì)胞可促進(jìn)ALP分泌，一部分ALP參與骨鈣化，一部分ALP釋放到血液中。血中ALP有50%來源于骨組織，其它主要來源于肝臟，極少量來源于小腸和胎盤[10]。血清ALP反映成骨細(xì)胞活性，值高則說明活躍的成骨細(xì)胞多，骨質(zhì)量好。10個廠家的骨肽原液給藥組大鼠血清中的ALP活性均有一定程度的增加，有6個廠家的骨肽原液在增加ALP活性方面差異有顯著性。TRACP反映骨吸收及抑制破骨細(xì)胞的活性，它具有降解骨基質(zhì)中鈣磷礦化底物的作用，其值越低說明越能抑制破骨細(xì)胞活性，骨質(zhì)量越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，10個廠家的骨肽原液給藥組大鼠血清中的TRACP活性均有一定程度降低，有8個廠家的骨肽原液在增加TRACP活性方面差異有顯著性。據(jù)文獻(xiàn)報道，骨組織形態(tài)學(xué)也是評價骨質(zhì)疏松藥物藥效學(xué)的重要方法，因?yàn)樾螒B(tài)學(xué)是主觀指標(biāo)，為了客觀評價，我們采用NDP掃描原件作為骨形態(tài)學(xué)測算，其中骨小梁面積、骨小梁數(shù)量、骨小梁面積比反映骨量變化；骨小梁分離度反映了骨質(zhì)疏松程度，分離度越高表明骨組織越疏松[11-12]。10個廠家的骨肽原液給藥組大鼠股骨病理計量分析結(jié)果顯示，不同廠家的骨肽原液均在不同程度上改善以上這些指標(biāo)。通過以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，骨肽原液可通過調(diào)節(jié)不同骨代謝指標(biāo)，達(dá)到改善去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松的作用。

Fig 6 ALP activity in serum of different groups of rats(mmol·L-1)

*P<0.05vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig 7 TRACP activity in serum from

*P<0.05vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

綜上所述，通過各指標(biāo)對10個廠家的骨肽原液進(jìn)行對比，全面評價了全國大部分廠家骨肽原液的有效性差異，從骨密度及骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)兩方面評價骨質(zhì)量，可對骨肽這一復(fù)雜制劑的藥效進(jìn)行判斷；通過分析骨代謝標(biāo)志物，對其作用機(jī)制做出初步分析；對不同廠家產(chǎn)品進(jìn)行對比，有效地反映骨肽藥物的生物活性。為進(jìn)一步建立骨肽原液生物活性測定方法提供了研究基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。