阮紅峰，應(yīng)忠明，羅 環(huán)

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷研究所，浙江 杭州 310053；2. 臺(tái)州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 臺(tái)州 317200；3. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是兒童最常見且致死性極高的實(shí)體腫瘤之一[1]。由NB所致死亡人數(shù)占所有兒童腫瘤死亡總數(shù)的15%[2]。分子靶向治療是近年腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3]。TAZ是一個(gè)包含WW-domain結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄共激活子，參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移，并能預(yù)測(cè)部分腫瘤患者的預(yù)后情況[4]。針對(duì)Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫NB腫瘤組織的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TAZ基因在NB腫瘤組織中呈高表達(dá)，且隨著NB的惡化，表達(dá)逐漸升高。而TAZ是否參與NB的形成及惡化尚未完全明確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人NB細(xì)胞株SH-SY5Y由浙江大學(xué)藥學(xué)院陳忠教授惠贈(zèng)；慢病毒包裝細(xì)胞293T購自于ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2試劑 KOD Plus NEO高保真酶購自Toyobo公司；G418、嘌呤霉素和強(qiáng)力霉素(DOX)購自Sigma公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自寶生物公司。

1.1.3儀器 凝膠電泳、qPCR分析儀和Western blot系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1pLVX-TRE3G-TAZ質(zhì)粒的構(gòu)建 通過設(shè)計(jì)無縫克隆TAZ引物(Tab 1)，KOD Plus NEO高保真酶擴(kuò)增TAZ序列。無縫連接至誘導(dǎo)過表達(dá)載體pLVX-TRE3G。連接產(chǎn)物經(jīng)DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化、涂板和氨芐抗性篩選，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR，陽性進(jìn)一步送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)。

Tab 1 Primers for cloning TAZ fragments

1.2.2TAZ慢病毒的包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 將pLVX-TRE3G-TAZ及pLVX-Tet3G分別與慢病毒包裝質(zhì)粒sPax、VSVG共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，制備慢病毒LV-TAZOE和LV-control用于感染SH-SY5Y細(xì)胞，48 h后加入G418(300 mg·L-1)和嘌呤霉素(1 mg·L-1)篩選96 h，獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞系。

1.2.3TAZ表達(dá)水平的驗(yàn)證 給予上述獲得細(xì)胞系添加DOX(200 μg·L-1)誘導(dǎo)48 h，通過設(shè)計(jì)TAZ定量檢測(cè)引物(Tab 2)，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別對(duì)該細(xì)胞TAZ的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。

Tab 2 Primers for qPCR assay

2 結(jié)果

2.1TAZ條件性過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定為構(gòu)建TAZ條件性過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，利用高保真酶擴(kuò)增獲得1233 bp的TAZ目的片段，將其連接至BamHI/MluI雙酶切的pLVX-TRE3G載體，連接產(chǎn)物經(jīng)挑取相應(yīng)克隆，經(jīng)PCR鑒定陽性后，進(jìn)一步測(cè)序比對(duì)分析，表明成功獲得誘導(dǎo)性過表達(dá)TAZ質(zhì)粒pLVX-TRE3G-TAZ。

2.2 誘導(dǎo)性過表達(dá)TAZ的SH-SY5Y細(xì)胞株的建立和驗(yàn)證利用上述構(gòu)建pLVX-TRE3G-TAZ包裝慢病毒LV-TAZOE感染SH-SY5Y，經(jīng)抗生素篩選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株。qPCR實(shí)驗(yàn)表明，LV-TAZOE組細(xì)胞，在DOX誘導(dǎo)48 h后，其TAZ的mRNA水平是對(duì)照組的10倍(P<0.01)。與此類似，Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DOX誘導(dǎo)后LV-TAZOE組SH-SY5Y細(xì)胞TAZ蛋白含量顯著增多。上述結(jié)果表明，我們成功獲得可誘導(dǎo)TAZ過表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞株。

3 討論

HIPPO信號(hào)參與腫瘤各種生物學(xué)行為是近年的研究熱點(diǎn)，其關(guān)鍵下游轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡、組織再生、器官大小的關(guān)鍵因子，是多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的潛在靶向標(biāo)記物[5]。本研究通過將TAZ克隆到誘導(dǎo)性過表達(dá)慢病毒載體pLVX-TRE3G并制備慢病毒感染SH-SY5Y成功獲得條件性誘導(dǎo)過表達(dá)TAZ的SH-SY5Y細(xì)胞，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究TAZ是否參與NB的形成及惡化提供了關(guān)鍵的材料。