孫紅梅　陸澤林　趙幻?！∴嶏w　李晶　劉明　越皓　于珊珊

摘 要 利用定向進(jìn)化技術(shù)重組糖苷酶ABQ，轉(zhuǎn)化不同結(jié)構(gòu)的三萜類皂苷（商陸皂苷甲、三七皂苷R1和柴胡皂苷A），通過高分離度液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，闡明其轉(zhuǎn)化機(jī)制。結(jié)果表明，重組糖苷酶ABQ能夠催化商陸皂苷甲、三七皂苷R1和柴胡皂苷A側(cè)鏈糖苷鍵的水解，轉(zhuǎn)化為商陸皂苷乙、三七皂苷R2、柴胡次皂苷F和柴胡皂苷元F。根據(jù)色譜-質(zhì)譜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)分析，ABQ對(duì)這3種三萜皂苷表現(xiàn)出不同的底物選擇性，重組糖苷酶ABQ能夠催化商陸皂苷甲C-3位外側(cè)的葡萄糖水解，生成商陸皂苷乙;三七皂苷R1的C-20位葡萄糖被水解， 生成三七皂苷R2;重組糖苷酶ABQ能夠首先催化柴胡皂苷A的C-3位葡萄糖水解， 生成柴胡次皂苷F，并繼續(xù)催化C-3位的巖藻糖苷水解，生成柴胡皂苷元F。定向進(jìn)化技術(shù)重組酶能夠提高酶活力和作用環(huán)境適應(yīng)能力，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用通過原型和產(chǎn)物實(shí)時(shí)檢測(cè)評(píng)價(jià)重組酶的作用。

關(guān)鍵詞 三萜皂苷; 生物轉(zhuǎn)化; 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用; 酶定向進(jìn)化技術(shù)

1 引 言

三萜皂苷是自然界中廣泛存在的一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，是由三萜皂苷元和糖以及其它有機(jī)質(zhì)組成，存在于許多中藥（如威靈仙、三七、柴胡、商路）中，具有廣泛的藥理活性，如抗癌、抗炎、抗糖尿病、提高免疫力等生物學(xué)活性，目前，已從自然界發(fā)現(xiàn)2萬余種類型，常見的三萜皂苷主要包括四環(huán)三萜皂苷和五環(huán)三萜皂苷兩大類。四環(huán)三萜可分為羊毛脂烷型、達(dá)瑪烷型、葫蘆素烷型、原萜烷型、環(huán)菠蘿蜜烷型等;五環(huán)三萜可分為齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型等。其中，達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜和齊墩果酸型五環(huán)三萜是最為常見的兩種三萜類皂苷，因而對(duì)這兩類皂苷的研究也是目前的熱點(diǎn)[1～7]。商陸皂苷甲和柴胡皂苷A均為齊墩果酸型五環(huán)三萜，前者是在其皂苷元基礎(chǔ)上C-3位糖側(cè)鏈由一分子木糖和一分子葡萄糖以β-（1，4）糖苷鍵連接而成，后者為其皂苷元上的C-3位糖側(cè)鏈由一分子巖藻糖和一分子葡萄糖以β-（1，3）糖苷鍵組成;三七皂苷R1為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜，在C-20位連接一個(gè)葡萄糖，C-3位糖側(cè)鏈由一分子木糖和一分子葡萄糖組成，其連接方式以β-（1，2）糖苷鍵連接。以上3種三萜皂苷具有重要的藥理活性，如商陸皂苷甲具有保護(hù)肝臟的作用， 柴胡皂苷A具有抑制病毒的活性， 三七皂苷R1對(duì)糖尿病具有治療等作用[8～10]。

三萜皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異使其在生物利用度及生物活性等方面存在較大差別。如苷的極性與它所連接的糖基數(shù)量成正比，因而苷的極性比其次生苷或苷元的極性大，對(duì)應(yīng)脂溶性相對(duì)較低，從而不利于吸收[11]。近期的研究還表明，三萜皂苷去糖基化后的代謝或轉(zhuǎn)化產(chǎn)物表現(xiàn)出了更好的生物可吸收性及藥理活性。如在治療冠脈結(jié)扎導(dǎo)致的大鼠心肌缺血方面，三七皂苷R2的藥效活性比三七皂苷R1高[12]，三七皂苷R2與三七皂苷R1具有相同的皂苷元結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)差別在于C-20位連接葡萄糖殘基數(shù)量的不同，三七皂苷R1的C-20位連接一個(gè)葡萄糖， 而三七皂苷R2的C-20位無糖基取代，推測(cè)糖基的數(shù)量不同導(dǎo)致其藥理活性的差異;商陸皂苷甲是商路的主要活性成分，因其具有顯著的抗炎活性而得到越來越多的重視，然而商路皂苷甲的強(qiáng)溶血性極大地限制了其應(yīng)用。通過生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)商路皂苷甲進(jìn)行去糖基化處理后， 生成的商路皂苷乙不僅溶血性降低，抗炎活性也得到進(jìn)一步增強(qiáng)[13，14]。因而，通過三萜皂苷的去糖基化結(jié)構(gòu)修飾有望獲得藥效更加顯著、安全低毒的皂苷化合物。

去糖基化可通過熱轉(zhuǎn)化、溫和酸水解、酶水解、微生物轉(zhuǎn)化法等方法實(shí)現(xiàn)，其中，微生物轉(zhuǎn)化和酶水解因其具有較高的底物特異性及低副產(chǎn)物和高產(chǎn)率的特性而被廣范應(yīng)用[15]。于蓓蓓等[16]報(bào)道了在腸道微生物作用下柴胡皂苷A轉(zhuǎn)化為柴胡次皂苷F，柴胡次皂苷F又進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷元F。Cui等[17]報(bào)道了應(yīng)用葡萄糖苷酶將商路皂苷甲轉(zhuǎn)化為商路皂苷乙。本研究組之前報(bào)道了利用重組內(nèi)切纖維素酶Fpendo5A轉(zhuǎn)化三七總皂苷并獲得去糖基化皂苷化合物的研究[18]。到目前為止，能用于商路皂苷、柴胡皂苷及三七皂苷轉(zhuǎn)化的微生物及酶的數(shù)量仍然較少，極大地限制了其理論研究及應(yīng)用開發(fā)，因此，開發(fā)可用于轉(zhuǎn)化商陸皂苷、柴胡皂苷、三七皂苷的新型酶，從而獲得高效、穩(wěn)定、低毒的活性皂苷具有重要意義。

重組糖苷酶ABQ來源于Flavobacterium johnsoniae菌， 在65℃、 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH=5.0）的條件下，具有很好的活性，此酶反應(yīng)條件溫和，適用于皂苷轉(zhuǎn)化的研究。本研究利用重組糖苷酶ABQ對(duì)商陸皂苷甲、柴胡皂苷A和三七皂苷R1進(jìn)行轉(zhuǎn)化，應(yīng)用高效液相色譜儀和快速分離液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)3種三萜皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，從而闡明其轉(zhuǎn)化機(jī)制。 本研究結(jié)果將有助于三萜皂苷生物轉(zhuǎn)化工藝的開發(fā)，同時(shí)為三萜皂苷的藥理研究及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ThermoU-3000型高效液相色譜儀、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）; Agilent RRLC 1200 SL-6520 Q-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）; 5811GK981477臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）; Medlum-S400超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）; MLS-3751L高壓蒸汽滅菌器（日本Panasonic公司）。

柴胡皂苷A、商陸皂苷甲、三七皂苷R1的皂苷標(biāo)品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）; 乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher試劑公司）; 對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃半乳糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-呋喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃鼠李糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃木糖苷、鄰硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、纖維二糖、龍膽二糖、昆布二糖、蔗糖（純度98%，上海源葉生物科技有限公司）; 異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Kanamycin Sulfate（純度≥99%，北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 重組糖苷酶ABQ的表達(dá)及純化 在100 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程菌，于37℃以180 r/min 轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)移至 2 L LB 液體培養(yǎng)基中，相同的培養(yǎng)條件，當(dāng)菌液在600 nm處的吸光度值（OD 600）達(dá)到0.6～0.8時(shí)，在培養(yǎng)基中加入1 mol/L IPTG，于30℃、120 r/min 轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)過夜; 將發(fā)酵液于4℃以8000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集菌體。稱取約5 g菌體，加入50 mL 20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH=5.0）重懸，冰浴下超聲破碎40 min，于4℃以10000 r/min離心40 min后，收集上清液; 采用鎳柱親和層析法純化，將收集到的蛋白于相同的緩沖液中透析過夜，利用SDS-PAGE電泳鑒定樣品純度，最后將酶于-20℃保存，用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究。

2.2.2 底物選擇性測(cè)定 測(cè)定糖苷酶ABQ對(duì)不同糖苷底物的水解活力，底物包括對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃半乳糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-呋喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃木糖苷、鄰硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、龍膽二糖、纖維二糖、昆布二糖、蔗糖。

采用比色法[19]，測(cè)定重組酶ABQ水解對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃半乳糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-呋喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃鼠李糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃木糖苷、鄰硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷的水解活力。實(shí)驗(yàn)組為50 μL 20 mmol/L底物加入10 μL 0.040 mg/mL酶溶液，補(bǔ)加20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH=5.0）至總體積為100 μL，每個(gè)底物均做3個(gè)平行樣品，反應(yīng)的樣品放于65℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10 min。時(shí)間結(jié)束后，反應(yīng)樣品立即放于冰水中終止反應(yīng)，測(cè)定450 nm處的吸收值?？瞻捉M總反應(yīng)體系為100 μL， 在50 μL 20 mmol/L 底物中加入50 μL 20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH=5.0），同上述實(shí)驗(yàn)組操作相同，作為對(duì)照。

采用經(jīng)典的Miller方法[20]，測(cè)定重組酶ABQ水解蔗糖、纖維二糖、龍膽二糖、昆布二糖的活力。還原糖的定量分析使用DNS試劑（3，5-Dinitrosalicylic acid reagent）。酶的水解活力通過測(cè)定糖底物所釋放的還原糖量確定。將含有質(zhì)量體積濃度1%底物（Sucrose、Gentiobiose、Cellobiose、Laminaribiose）的緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱15 min。加入適量酶液，與底物溶液充分混合，在65℃條件下反應(yīng)1～5 min。終止反應(yīng)后，取500 μL反應(yīng)液加入到1 mL DNS 試劑中，煮沸5 min，流水冷卻后，高速離心，并補(bǔ)加去離子水至20 mL，將測(cè)得的A529與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖量（用相當(dāng)量的葡萄糖表示）。

酶活力單位（IU）定義：每分鐘催化產(chǎn)生1 μmoL還原糖所需的酶量定義為1 IU。

2.2.3 分析條件

色譜條件： C18反相色譜柱（5 cm×3.0 mm，2.7 μm; 美國(guó)Supelco公司），柱溫30℃; 流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸溶液，B為乙腈; 二元線性梯度洗脫： 0～5 min，15%～19% B; 5～10 min，19% B; 10～13 min，19%～25% B; 13～15 min，25%～28% B; 15～18 min，28% B; 18～22 min，28%～30% B; 22～25 min，30%～35% B;? 25～30 min，35%～40% B; 30～35 min，40%～60% B; 35～38 min，60%～80% B; 38～40 min，80%～100% B; 40～45 min，100% B; 流速0.4 mL/min; 進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件： 電噴霧負(fù)離子模式，干燥氣溫度（Gas temperature） 350℃，干燥氣流速（Drying gas）8 L/min， 霧化氣壓力255 kPa，傳輸毛細(xì)管電壓（DualESI VCap）3500 V，碎裂器電壓（Fragmentor）175 V，錐孔電壓（Skimmer）65 V。

2.2.4 重組糖苷酶ABQ轉(zhuǎn)化三萜皂苷

配制1 mg/mL的3種皂苷溶液作為底物，等體積加入一定濃度的酶液，于65℃下反應(yīng)，間隔時(shí)間取樣，加入等體積的水飽和正丁醇終止反應(yīng)，渦旋2～3 s后，于4℃以10000 r/min離心2 min，靜置10 min，取等量的上層正丁醇溶液， 60℃水浴條件下蒸干，收集固體樣品，用甲醇復(fù)溶并定容至1 mL，用于高效液相色譜儀和快速分離液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 糖苷酶ABQ的底物選擇性

為獲得糖苷酶ABQ對(duì)不同糖苷鍵的特異性，在65℃， 20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH=5.0）的條件下，考察了糖苷酶ABQ對(duì)帶有不同糖苷鍵的底物的催化活性，結(jié)果（表1）表明，ABQ對(duì)對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷的水解活力最大; 對(duì)鄰硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖糖苷鍵、龍膽二糖糖苷鍵、纖維二糖糖苷鍵表現(xiàn)出較低的水解活力; 對(duì)對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃半乳糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基 -α-L-吡喃鼠李糖苷、對(duì)硝基苯基 -β-D-吡喃木糖苷、昆布二糖、蔗糖沒有水解活性。由此可見，重組糖苷酶ABQ屬于β-葡萄糖苷酶類。

3.2 糖苷酶ABQ轉(zhuǎn)化三萜皂苷的產(chǎn)物鑒定

利用高效液相色譜法，對(duì)ABQ轉(zhuǎn)化3種皂苷底物的轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行了研究（圖1），比較3種皂苷底物轉(zhuǎn)化前后的高效液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，商陸皂苷甲在反應(yīng)2 h時(shí)明顯減少并伴有新化合物產(chǎn)生，底物與產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為12.7和14.2 min; 糖苷酶ABQ對(duì)三七皂苷R1具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力，反應(yīng)0.5 h時(shí)全部底物轉(zhuǎn)化成單一產(chǎn)物，底物與產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為8.3和12.4 min; 糖苷酶ABQ轉(zhuǎn)化柴胡皂苷A時(shí)，反應(yīng)4 h后有兩個(gè)產(chǎn)物峰，柴胡皂苷A與其產(chǎn)物1和2的保留時(shí)間分別為17.7、19.2 和20.5 min。 由此可見，糖苷酶ABQ能夠轉(zhuǎn)化商陸皂苷甲、三七皂苷R1、柴胡皂苷A。為進(jìn)一步闡明其轉(zhuǎn)化機(jī)制，利用RRLC-Q-TOF-MS對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可以獲得化合物的保留時(shí)間和精確質(zhì)荷比，通過以適當(dāng)?shù)呐鲎材芰渴惯x擇的母離子充分碎裂，獲得化合物的特征碎片離子信息，從而闡明化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。以下離子的m/z值均用整數(shù)表示。

圖2A中的離子m/z 825為商陸皂苷甲的[MH＼]準(zhǔn)分子離子，m/z 663為母離子丟失一分子葡萄糖而產(chǎn)生的[MHGlc＼]碎片離子，m/z 531為[MHGlc＼]繼續(xù)丟失一分子木糖基得到的碎片離子[MH Glcl＼]。商路皂苷甲轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的串聯(lián)質(zhì)譜見圖2B，準(zhǔn)分子離子[MH＼]為m/z 663， m/z 531為[MH＼]丟失一分子木糖基而產(chǎn)生的[MH＼]離子，m/z 531是齊墩果酸型五環(huán)苷元的特征峰，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[21]，鑒定此產(chǎn)物為商陸皂苷乙。

同樣，圖2C中的m/z 931為母離子三七皂苷R1的[MH＼]準(zhǔn)分子離子，碎片m/z 769為母離子丟失一分子Glc 殘基產(chǎn)生的 [MHGlc＼]碎片離子，m/z 637為[M HGlc＼]繼續(xù)失去一分子木糖基得到的 [MHGlc ＼] 碎片離子，m/z 637繼續(xù)丟失一分子Glc殘基產(chǎn)生的碎片離子m/z 475為[MH＼]離子，而m/z 475為三七皂苷R1的達(dá)瑪烷型四環(huán)皂苷元的特征離子。對(duì)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，圖2D中的m/z 769為[MH＼]準(zhǔn)分子離子，m/z 637為[MH＼]丟失一分子Xyl 殘基產(chǎn)生的[MH＼]碎片離子，m/z 637為再丟失一分子 Glc殘基得到的碎片離子，m/z 475為達(dá)瑪烷型四環(huán)皂苷元的特征離子，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[22]，鑒定此化合物為三七皂苷R2。

由圖2E可知，m/z 779為母離子的[MH＼]準(zhǔn)分子離子，m/z 617為母離子丟失一分子葡萄糖殘基而得到的[MH＼]離子，離子[MH＼]繼續(xù)丟失一分子巖藻糖殘基得到離子m/z 471[MH＼]碎片離子。通過圖2F可知m/z 617為產(chǎn)物1的[MH＼]準(zhǔn)分子離子，m/z 471為母離子丟失一分子巖藻糖殘基得到的[MH＼]離子，m/z 471是齊墩果酸型五環(huán)皂苷元的特征離子，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[23，24]，鑒定產(chǎn)物1為柴胡次皂苷F，產(chǎn)物2為柴胡皂苷元F。

3.3 糖苷酶ABQ轉(zhuǎn)化三萜皂苷的轉(zhuǎn)化機(jī)制研究

通過以上對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)研究，進(jìn)一步對(duì)ABQ轉(zhuǎn)化3種三萜皂苷的轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行分析。商陸皂苷甲和柴胡皂苷A均為齊墩果酸型五環(huán)三萜，前者是在其皂苷元基礎(chǔ)上C-3位糖側(cè)鏈由一分子木糖和一分子葡萄糖以β-（1，4）糖苷鍵連接而成，后者為其皂苷元上的C-3位糖側(cè)鏈由一分子巖藻糖和一分子葡萄糖以β-（1，3）糖苷鍵組成。三七皂苷R1為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜，在C-20位連接一個(gè)葡萄糖，C-3位糖側(cè)鏈由一分子木糖和一分子葡萄糖組成，其連接方式為β-（1，2）糖苷鍵連接。

經(jīng)鑒定，糖苷酶ABQ與商陸皂苷甲在反應(yīng)2 h后C-3位外側(cè)的葡萄糖被水解生成商陸皂苷乙; ABQ與三七皂苷R1在反應(yīng)0.5 h后底物完全被轉(zhuǎn)化，C-20位的葡萄糖被水解生成三七皂苷R2; ABQ與柴胡皂苷A在反應(yīng)4 h后C-3位的葡萄糖首先被水解生成柴胡次皂苷F，繼續(xù)水解C-3位的巖藻糖生成柴胡皂苷元F。綜上，推測(cè)ABQ轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化三萜皂苷的轉(zhuǎn)化路徑應(yīng)為：糖苷酶ABQ可使部分三萜皂苷發(fā)生側(cè)鏈糖基的水解反應(yīng)，即商陸皂苷甲→商陸皂苷乙，三七皂苷R1→三七皂苷R2，柴胡皂苷A→柴胡次皂苷F→柴胡皂苷元F（圖3）。通過糖苷酶的轉(zhuǎn)化作用，使得皂苷底物的部分糖側(cè)鏈發(fā)生水解，從而獲得4種去糖基化皂苷化合物， 結(jié)構(gòu)的改變使得脂溶性發(fā)生變化，生物利用度進(jìn)一步增強(qiáng)，藥理活性也隨之產(chǎn)生差別。此項(xiàng)轉(zhuǎn)化研究為未來應(yīng)用該酶定向制備4種三萜皂苷（商陸皂苷乙、三七皂苷R2、柴胡次皂苷F和柴胡皂苷元 F）提供了新途徑，同時(shí)，也為新藥的篩選提供更多的候選分子，對(duì)于開發(fā)相關(guān)藥品及保健食品具有重要作用。

4 結(jié) 論

利用高效液相色譜（HPLC）和高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（RR LC-Q-TOF-MS）及其串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)對(duì)重組糖苷酶ABQ轉(zhuǎn)化3種三萜皂苷的產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，通過比較轉(zhuǎn)化前后的液相色譜圖變化以及結(jié)合精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜碎片信息，快速鑒定出商陸皂苷甲的酶水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為商陸皂苷乙，三七皂苷R1的酶水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為三七皂苷R2，柴胡皂苷A的酶水解產(chǎn)物為柴胡次皂苷F和柴胡皂苷元F。因此，重組糖苷酶ABQ催化商陸皂苷甲，三七皂苷R1和柴胡皂苷A的轉(zhuǎn)化路徑分別是商陸皂苷甲→商陸皂苷乙; 三七皂苷R1→三七皂苷R2; 柴胡皂苷A→柴胡次皂苷F→柴胡皂苷元F。本研究為新酶源的開發(fā)及部分重要三萜皂苷的定向轉(zhuǎn)化研究提供了方法。

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Abstract The directed evolution technology was used for recombination of glycosidase ABQ to transform triterpenoid saponins with different structures， including Esculentoside A， Notoginsenoside R1 and Saikosaponin A， and the biotransformation process of the triterpenoid saponins was investigated by rapid resolution liquid chromatography coupled with quadruple-time-of-flight mass spectrometry （RRLC/Q-TOF-MS）. The result showed that ABQ had high activities for Esculentoside A， Notoginsenoside R1， Saikosaponin A， however， it showed different substrates selectivity for the three saponins. Besides， ABQ could catalyze the hydrolysis of C-3 lateral glucose of Esculentoside A and the C-20 lateral glucose of Notoginsenoside R1 to produce Esculentoside B and Notoginsenoside R2， repectively. And the recombinant glycosidase ABQ could catalyze the hydrolysis of C-3 lateral glucose of Saikosaponin A to produce Prosaikogenin F and then further catalyzed the hydrolysis of C-3 fucoside to produce Saikogenin F. In brief， the directed evolution technology could improve enzyme activity and environmental adaptability， and the chromatography-mass spectrometry could be used to evaluate the role of recombinant enzymes by real-time detection of prototypes and products.

Keywords Triterpenoid saponins; Biotransformation; Liquid Chromatography-mass spectrometry; Enzyme directed evolution

（Received 15 August 2019; accepted 8 November 2019）

This work was supported by the Jilin Province Science and Technology Development Plan Project （No.20170307029YY） and the Jilin Province Department of Education "13th Five-year" Scientific Program （No. JJKH2018125K）.